PD-L1相关作用机制及其在肿瘤中的研究进展

陈文生 综述 赵颖海 审校

广东医科大学病理系，广东 湛江 524023

程序死亡分子蛋白1(programmed death-1)是由ISHIDA等[1]在1992年通过消减法技术中发现的。其广泛存在于各类淋巴及巨噬细胞表面，而在活化的T淋巴细胞的表面因子也是近年来的研究热点。在正常情况下，T细胞是人体内重要的细胞免疫细胞，可以识别和杀伤细菌、病毒以及人体内失去调控变异细胞等功能。而与其相对应的程序性死亡蛋白配体1(programmed cell death 1 ligand 1，也称 PD-L1)是由DONG等[2]从胎盘基因文库中发现。PD-L1属于B7家族，主要存在于胎盘、肺、心、肝及免疫器官，其他正常组织经过诱导也能表达，其主要作用是调节人体免疫功能。当PD-L1与T细胞中PD-1蛋白配对结合时，就会使得免疫细胞失去攻击能力，以此保护正常组织。肿瘤细胞正充分利用其特性，通过诱导后其表面PD-L1表达功能上调从而直接或间接抑制机体内的T细胞对自身免疫杀伤癌细胞功能，进而成为导致肿瘤的免疫逃逸重要原因之一[3]。因此PD-1与PD-L1研究有望成为肿瘤免疫治疗的重要手段。现对PD-1/PD-L1的相关作用机制及目前肿瘤治疗的相关进展进行综述。

1 PD-L1/PD-L2分子机制

PD-L1(B7-H1)和 PD-L2(B7-DC)均为 B7同系物，并由位于染色体9 p24.1上的CD274基因编码，其已均被证实为受体PD-1的配体[2，4]。在机体中，其在不同组织中差异性表达，但主要在T和B淋巴细胞、树突状细胞(DC)、单核细胞、间充质干细胞(MSC)、骨髓(BM)产生的肥大细胞及各种免疫器官中表达[5-6]，此外部分细胞经诱导后均可表达PD-L1，如IL-21可诱导CD19+B细胞表达PD-L1，γ链细胞因子可诱导T细胞表达PD-L1[2]，以及干扰素(IFN)-γ可诱导激活非淋巴细胞上的PD-L1表达，如内皮细胞、单核细胞等[8]。相关研究表明PD-L1在细胞区室中也广泛存在[9]，包括存在于细胞膜之中的PD-L1(mPD-L1)，还包括细胞质中的PD-L1(cPD-L1)、核中的PD-L1(nPD-L1)、血清中的PD-L1(sPD-L1)和外泌体中的PD-L1[9-14]。而在PD-L1 mRNA的表达中，CD274基因产生了两个可供选择的转录本。通过对约800个碱基序列(bp)进行测序，发现其分子量为33 kDa，编码290个氨基酸。PD-L1是一种跨膜糖蛋白，由一个包含免疫球蛋白(Ig)样结构域的大胞外区域、一个疏水跨膜结构域以及30个氨基酸的胞质尾部组成，不包含典型的信号基序[15]。此外，PD-L1启动子具有约220 bp的CpG甲基化位点，研究表明其可控制表观遗传[16]。PD-L2是PD1的第二配体，其与PD-L1大约有22%氨基酸同源[17]。与PD-L1相比，PD-L2的表达非常局限于活化的树突状细胞、巨噬细胞、BM来源的肥大细胞和腹膜B1细胞[18]。LPS和BCR可诱导B细胞表达PD-L2，GM-CSF和IL-4可诱导dc表达PD-L2[17]。这两种PD-1配体在恶性肿瘤上都有被发现，但与PD-L1相比，PD-L2的表达程度较低[19]。

2 PD-1/PD-L1介导的信号转导

PD-1与PD-L1的相互作用在维持免疫系统与抗肿瘤免疫反应之间的平衡发挥关键性作用。PD-1通过产生与T细胞的受体(TCR)和CD28共同相互抑制的微团簇，然后通过利用其在细胞上的组织相容的特性与抗原PD-L1相识别后激活原始T细胞，激活相关信号最终抑制细胞中葡萄糖的消耗、细胞因子的大量产生、T淋巴细胞的增殖和存活，此外它进一步阻止了包括与GATA-3、T-bet和Eomes在内的effector功能相关的TF表达[20]。因此其通过抑制T细胞介导的免疫反应，在炎症及肿瘤细胞的免疫反应中同样具有抑制作用。在肿瘤的微环境之中，PD-1通过TCR下游的信号可以活化T细胞表面表达，它在与配体PD-L1结合后通过传递抑制信号以调节T细胞活化，PD-1连接减弱了TCR介导的信号传导，并直接损害PI3 K-Akt和Ras/MEK/ERK途径的活性[21]，因此，PD-1介导的抑制途径与降低T细胞增殖、促进T细胞凋亡、导致T细胞衰竭密切相关。此外，PD-1与配体PD-L1相互结合导致CD3、ZAP70和蛋白激酶C的磷酸化降低，抑制T细胞 ERK活化，抑制 B细胞Igβ、Syk、PLC-γ2和ERK的钙动员和磷酸化[22-23]。不同细胞类型的PD-1与PD-L1结合有不同的功能。在影响T细胞中，PD-1通过多种方式抑制其活性，例如通过影响细胞周期、增殖、存活和细胞因子产生的多种调节因子来抑制细胞周期的进展。此外，PD-1还参与TGF-β介导的信号转导，促进其增殖。Ras-PD-1调节SWAT3并与TGF-β介导的信号协同作用[24]。其次，PD-1改变了活化的T细胞的代谢过程，从而产生更多的氧化微环境。关于PD-1信号转导途径已得到很好的认知，但其信号转导在肿瘤免疫治疗方面所面临的问题仍是当今的研究热点。

3 PD-1/PD-L1与肿瘤的免疫逃逸

肿瘤通过多种途径抑制损害肿瘤特异性免疫细胞、T细胞、巨噬细胞和其他与免疫应答相关的细胞的功能，从而导致肿瘤免疫逃逸，这些途径主要包括：促进T细胞表面抑制受体表达和抑制T细胞刺激性受体如T细胞受体(TCR)/CD3和CD28，通过聚集免疫抑制白细胞，逃避免疫的监控，从而为肿瘤细胞创造了一个可以阻止抗肿瘤免疫反应的微环境，包括抗原提呈细胞的缺陷、抑制细胞负性免疫调节和有缺陷的抗肿瘤T细胞。PD-1作为一种免疫抑制分子的受体，可阻止人类T淋巴细胞的增殖和活化，在免疫逃逸中发挥重要作用。PD-1/PD-L1信号通路相互作用导致肿瘤的免疫逃逸是目前的研究热点也是研究的难点，目前尚未完全阐释清楚，但是目前研究结果表明可能与以下几个方面密切相关，(1)PD-1/PD-L1相互作用激活一种亦可抑制TCR介导的T细胞活化和增殖的信号，也可抑制干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-2等细胞因子的分泌，从而促进细胞毒性T细胞凋亡和调节性T细胞分化[25]。(2)PD-L1促进肿瘤基质上皮细胞的间质化：上皮细胞间质化(EMT)是指上皮细胞在机体各种刺激下诱导上皮细胞向间质细胞的转变。在肿瘤的整个发生发展的过程中均可由EMT，从而促进肿瘤细胞的恶化性转变。CAO等[26]研究结果发现PD-L1一方面可导致肿瘤细胞中Twist和Slug的表达上调，另一方便可抑制E-cadherin的表达，诱导上皮细胞间质化，从而导致肿瘤细胞出现免疫逃逸，促进肿瘤进一步恶化。(3)许多参与T细胞活化的途径，包括主要组织相容性复合体(MHC)-TCR-ZAP70-RAS-GTPase(RAS)-ERK和CD80-CD28-PI3 K蛋白激酶B(AKT)途径等均受PD-1/PD-L1相互作用的调节[27]。因此PD-1/PD-L1信号通路对肿瘤免疫逃逸起着重要地位，而且这也是近年来PD-L/PD-L1作为免疫治疗重要的理论依据所在。

4 PD-1/PD-L1的表达调控

PD-L1的表达受多种肿瘤微环境的局部刺激信号和T淋巴细胞产生的干扰素(IFN)-γ诱导，有相关研究表明，NF-κB途径可以抑制和损害IFN-γ介导的PD-L1诱导表达[28]，研究人员发现使用NF-κB抑制剂同时也会导致PD-L1的表达下降。此外，肿瘤细胞在肿瘤微环境中表达PD-L1控制的刺激信号。许多炎性细胞因子可诱导PD-L1的表达。尤其是DC中的IL-1β、IL-6、IL-27、IL-10等[29]。致癌转录因子MYC在许多癌细胞中高表达。相关研究发现MYC可以与PD-L1的启动子相结合，可降低PD-L1的表达[30]。

肿瘤内基因突变、扩增与PD-L1的调控相关，由于PD-L1位于9 p24.1号染色体基因编码上，因此9 p24.1区域的扩增与多种癌症中PD-L1水平的升高密切相关[2，4]。而最近研究发现在三阴性乳腺癌中PD-L1的DNA拷贝数改变(CNAs)频率增高，其可直接导致PD-L1的表达增加[31]。

PD-L1的表达受肿瘤内的表观遗传改变而改变，如启动子DNA的甲基化、组蛋白修饰和microRNAs中在不改变遗传信息的情况下调节对DNA成分的识别和结合因素与转录因子，从而调节PD-L1的表达。PD-L1启动子的高甲基化与PD-L1的低表达密切相关。研究人员发现CD274启动子的高度甲基化可导致PD-L1表达下调/缺失[32]。而在许多癌症中均曾被报道过存在PD-L1启动子甲基化的现象，因此PD-L1启动子甲基化可能对肿瘤患者预测PD-1/PD-L1免疫治疗的疗效具有重要的临床意义。此外在组蛋白修饰相关修饰方面，包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化和ADP核糖化，也都可以调节PD-L1基因表达，非糖基化的PD-L1磷酸化后泛素-蛋白酶体系统可以降解。因此，针对PD-L1多泛素化可能是增强免疫检查点治疗的一种途径，PD-L1可在表皮生长因子上受到乙酰化酪氨酸磷酸化和单泛素化作用刺激，糖基化可导致PD-L1在肿瘤细胞中的表达稳定，包括肿瘤干细胞长蛋白半衰期，与逃肿瘤避免疫监视有关[17]。因此组蛋白修饰可能影响PD-L1介导的免疫抵抗，并可能成为增强的潜在靶点抗肿瘤免疫反应。作用于PD-L1的miRNA是含有约20个核苷酸的非编码单链RNA，最近研究表明miRNAs可以直接或间接调节PD-L1具有免疫调节潜能[33]。在某些情况下，靶向miRNA可使PD-L1表达下调，导致抑制肿瘤生长、侵袭以及增强T细胞反应和降低化疗耐药性有关。但也有部分miRNA可使PD-L1表达上调，从而导致相反的作用。研究发现在不同的小鼠模型实验中发现了靶向PD-L1的3'非翻译区的miRNAs如：miR-34、miR-200、miR-138和miR-570，导致 PD-L1表达下调[34]。但也有研究发现部分miRNA如：MiR-20、MiR-21和MiR-130b通过抑制抑癌基因(PTEN)的表达，间接导致PD-L1表达上调[35]。

PD-L1的表达受肿瘤内转录因子的调控。转录因子AP-1是由c-Jun、FOS、MAF或ATF组成的二聚体复合物。最近研究发现在霍奇金淋巴瘤中，PD-L1可通过AP-1与第一内含子的增强区相结合而诱导表达[36]。转录因子STAT3也参与调节PD-L1表达。DURAND等[37]研究发现在T细胞淋巴瘤中，STAT3通过与PD-L1启动子结合可导致PD-L1的表达上调，相反通过抑制STAT3可以导致PD-L1的表达下调。HIF-1α是非常重要的致癌因子，NOMAN等[38]研究发现缺氧诱导因子1α(HIF-1α)与 PD-L1近端启动子的结合刺激PD-L1的转录，因此HIF-1α的过度表达导致PD-L1的表达上调。此外，转录因子MYC在许多肿瘤细胞表达并参与肿瘤整个的发生、发展过程。但是MYC对PD-L1的调控仍不明确。部分研究报道发现肿瘤细胞中的MYC与PD-L1启动子结合导致PD-L1的表达下调，从而增强肿瘤的免疫杀伤能力[39]，但仍有部分研究者发现MYC转录因子通过其在肿瘤发生、发展和维持中的致病作用直接促进肿瘤的恶性转化[40]。

5 PD-1/PD-L1免疫治疗及耐药性研究进展

正是由于PD-1/PD-L1具有上述特点，因此其为当今世界开启了肿瘤免疫治疗的新时代，也使得肿瘤免疫治疗成为当今研究热点，其目的就是消除肿瘤的免疫逃逸，增强肿瘤的免疫效应从而达到高效、特异的治疗癌症。而经过近年来许多专家和学者的努力，PD-1/PD-L1免疫治疗在许多癌症治疗当中如恶行黑色素瘤、淋巴瘤、肝癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、尿路上皮癌等均取得明显疗效。目前已被FDA批准分为两类，一类是阻断PD-1/PD-L1轴PD-1抗体如单抗帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武利尤单抗(nivolumab)、cemiplimab，另一类是抗 PD-L1单抗atezolizumab、durvalumab和avelumab。虽然PD-1/PD-L1免疫治疗因个体的异质性，所以其疗效有较大差距，但其对比未使用免疫治疗剂的生存率有了明显提升，因此PD-1/PD-L1的异质性也是当今的难点与热点。而在PD-1/PD-L1免疫治疗的过程中，人们发现免疫治疗的耐药性也是当今仍未解决难点，而关于其免疫治疗耐药机制尚未完全清楚，但目前研究发现与以下几种机制有着密切关系，(1)肿瘤抗原表达缺失：肿瘤突变负担(TMB)为每百万基因突变包括编码错误、中排、插入、缺失等的总数[41]，而每当基因突变数增加时会产生更多新抗原，从而导致肿瘤被特异性T细胞攻击，增加了对PD-L1治疗的敏感性。因此高水平的TMB可导致PD-L1阻断敏感、低水平的TMB导致较低的免疫原性使得治疗效果差。(2)缺乏有效的抗原提呈细胞(APCs)：APCs是一类将抗原处理后并将其处理后层递给T细胞，然后T细胞发挥免疫反应，因此APCs在免疫治疗环节中起着很重要作用。其中树突状细胞(DC)是一类非常重要的人体抗原提呈细胞，人体DCs大多处于未成熟的状态，未成熟的DCs细胞具有较强的抗原性吞噬能力。在抗原刺激下，未成熟DCs可以分化为成熟DCs，成熟的DCs能够表达高水平的共刺激和抑制因子，在成熟过程中，树突状细胞从外周组织迁移到次级淋巴器官，与T细胞接触，刺激细胞免疫反应。DCs是目前发现的最有效APCs，能够影响特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的产生。同时肿瘤微环境能影响DCs的分布、分化与成熟[42]。(3)肠道菌群可以影响肿瘤发展和PD-1/PD-L1免疫治疗的效果：研究发现双杆菌可以刺激DCs，诱导其成熟，促进细胞毒性T细胞的激活和PD-1/PD-L1阻断的增加，从而增强机体的免疫反应[43]。(4)T细胞趋化因子：能够将免疫细胞吸引到特定部位，一方面，肿瘤和肿瘤组织中 的 基 质 细 胞 招 募 CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL3、CCL4、CCL5等趋化因子来招募NK细胞和ctl引起肿瘤反应；另一方面，肿瘤微环境中高水平的趋化因子如CCL2和 CCL22，通过招募 MDSCs、Tregs、m2等免疫相关抑制细胞来抑制免疫应答[44]。(5)参与肿瘤发生、发展过程中的各种信号转导通路：如PI3 K-AKT-mTOR参与细胞生存、增殖和分化等重要的细胞过程，MAPK途径的激活许多不同的细胞过程，如增殖、分化、运动、凋亡和存活，IFN-γ可上调MHC分子和PD-L1的表达，从而增强肿瘤抗原的递呈和对PD-1治疗的反应等。正因为目前PD-1/PD-L1免疫治疗的局限性，因此结合其他疗法如放疗、化疗等综合性治疗也成了当今重点发展方向。

6 展望

虽然PD-1/PD-L1的表达在许多不同来源的肿瘤均已得到证实并且与肿瘤的免疫逃逸有着密不可分的关系，但其作为治疗预后生物标志物的价值和免疫治疗利用的效率仍存在争议。因此，为了更好的利用它们的特性，仍需要更加深入的去了解其分子机制、信号转导、表达调控等各方面，才能更好突破PD-1/PD-L1在临床免疫治疗的局限性，为肿瘤诊治开辟新的方向。