水盐代谢相关激素在梅尼埃病发病中作用的研究

陈姿屈永涛郭明丽*

1华北理工大学耳鼻咽喉头颈外科（唐山063000）

2河北省人民医院耳鼻咽喉科（石家庄050051）

梅尼埃病是一种特发性内耳疾病，1861年由法国医师Prosper Ménière首次提出。本病发病率约为(10～157)／10万，患病率(16～513)／10万，女性多于男性(约1.3：1)，40～60岁高发，儿童MD患者约占3%[1]。其诱因包括劳累、精神紧张及情绪波动、睡眠障碍、不良生活事件、天气或季节变化等[2-4]。1938年Hallpike和Cairns报告[5]，本病的主要病理变化为膜迷路积水，目前这一发现已得到了许多学者的证实，然而膜迷路积水机制尚未阐明。目前临床治疗以经验及对症治疗为主，这些方案均有其局限性，为使临床治疗和预防MD发作更有针对性，其病因的研究逐渐成为热点，本文就水盐代谢相关激素在MD发病中可能的影响做一综述。

1 抗利尿激素与MD的关系

抗利尿激素（antidiuretic hormone，ADH）又称血管加压素（vasopressin，VP）、精氨酸血管加压素（arginine vasopressin，AVP），它由位于下丘脑视上核和视旁核的神经内分泌细胞合成，沿下丘脑-垂体束的轴突被转运，并储存在神经垂体中。ADH主要通过与其两种受体结合发挥作用，这两种受体分别为血管加压素1（vasopressin 1，V1）受体、血管加压素2（vasopressin 2，V2）受体。V1受体分布于血管平滑肌，激活后可引起平滑肌收缩，导致血流阻力增大及血压升高。V2受体主要分布于肾集合管主细胞基底膜，属于G蛋白耦联受体，激活后增加水的重吸收，浓缩尿液[6]。

2015年，蒋子栋等[7]将20只豚鼠连续7天腹腔注射ADH（SIGMA，V1880）,剂量为50μg/kg，每日一次，取存活豚鼠的颞骨分别进行火棉胶和冰冻切片，光学显微镜观察建模状况。结果显示ADH诱导膜迷路积水成功率73.7%（14/19），差异有统计学意义(P＜0.05)，因此作者认为内分泌代谢因素可能在膜迷路积水的形成中有一定作用。2010年，Marshall等[8]将微型渗透泵手术植入5只豚鼠背部组织中,以 1000U/kg/min（2.86ng/kg/min）的速率持续给予ADH，用药第7天后，给予豚鼠静脉内注射钆剂行颞骨3.0T MRI检查，发现在给予ADH前后脑干控制区域的信号强度没有显著变化，但是内耳MRI信号强度在给予ADH后比用药前明显增强。将整个耳蜗视图放大，发现外淋巴与内淋巴的信号均增加，同时还发现前庭和半规管内的信号也增加了。Marshall等认为血液迷路屏障通常只允许少量钆进入内淋巴液，本实验中豚鼠内淋巴液信号强度明显增强，推断可能是位于膜蜗管与前庭阶之间的前庭膜（Reissner’s membranes)破裂,外淋巴中钆剂进入内淋巴中造成内淋巴液信号强度增强。将豚鼠处死后取出颞骨行苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin，HE)，光学显微镜观察发现其Reissner’s膜的长度明显增加，甚至有几个样本中观察到破裂的Reissner’s膜，这表明ADH作用于内耳可导致膜迷路积水，但具体机制未阐明。

以上动物实验显示ADH作用于内耳可导致膜迷路积水，从而产生类似MD的病理变化，为了研究ADH在MD患者体内是否存在浓度变化，有学者进行了下列研究。

Kitahara等[9]检测105名确诊MD患者外周血ADH水平，其中单侧者87例，双侧者18例，以30名患有慢性中耳炎但没有任何直接内耳损伤的患者作为对照。分别在MD发作期和缓解期抽取血样，结果显示实验组外周血ADH浓度远高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

由上可知，ADH可作用于内耳，并可在MD患者外周血中测得有较高水平，那么是否可以通过临床干预，降低MD患者外周血中ADH浓度，从而减轻甚至控制其临床症状的发生和发展？2016年，Kitahara等[10]将297例MD患者随机分为四组，1组（74名患者，对照组）接受传统的口服药物；2组（75名患者）接受药物和充足的水摄入35mL/kg/天；3组（74名患者）接受药物治疗同时鼓膜切开置管；4组（74名患者）接受药物治疗和每晚在黑暗的环境中持续睡眠6～7小时，以维持荷尔蒙昼夜节律。此项研究为期2年，结果显示，在18-24个月期间无眩晕发生比例为：1组54.3%,2组 81.4%,3组84.1%，4组80.0%。抽取4组MD患者外周血检测ADH浓度，结果显示，除1组外，其余3组外周血ADH浓度均明显降低，且存在统计学意义。作者认为外周血ADH水平降低可以减轻MD的眩晕发作，但未对其机制做进一步探讨。查阅文献[6]可知，ADH分泌受多重因素的调节和影响，其中最重要的是血浆晶体渗透压和循环血量。当大量饮用清水后，血浆晶体渗透压降低，可引起ADH分泌减少。而在黑暗环境睡眠时，因平卧位静脉回心血量增多，对心肺感受器的刺激增强，经迷走神经传入至下丘脑的冲动增加，对ADH释放的抑制作用增加，故ADH释放可能减少。另外，不排除睡眠状态下血管紧张素Ⅱ分泌减少导致ADH分泌减少。但是，鼓膜切开置管影响ADH释放的机制尚不清楚。动物实验结果显示，ADH水平升高可能导致膜迷路积水；临床观察MD患者外周血ADH水平，确实高于对照组，并且ADH水平下降时，临床症状有所缓解。关于ADH调控膜迷路液体的机制目前有几个研究方向，一是ADH通过与V2受体结合，促使内淋巴囊上皮细胞内含有水通道蛋白2（Aquaporin2，AQP2）的囊泡转移并镶嵌到细胞的顶端膜，从而调控内耳液体。二是ADH作用于细胞间紧密连接蛋白实现对内耳液体量的控制。

AQP又名水孔蛋白，位于细胞膜上，在细胞膜上组成“孔道”，可控制水在细胞的进出，就像是“细胞的水泵”一样。2009年Nishimura等[11]选取12只健康Wistar大鼠，取其中8只大鼠内耳和内淋巴囊组织行RT-PCR实验，剩余4只大鼠内淋巴囊组织行免疫组化实验，两组实验同时证实AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP6、AQP7、AQP8、AQP9、V2受体mRNA在大鼠内淋巴囊中表达，证实内耳中存在ADH受体。为明确ADH作用于内耳的机制，2010年Maekawa等[12]分别取MD组及对照组内淋巴囊组织行RT-PCR实验，证实MD患者内淋巴囊中AQP2 mRNA表达明显高于对照组，且证实内淋巴囊中V2受体和AQP2 mRNA表达水平之间存在显著的正相关。Maekawa等为了明确V2受体和AQP2在人内淋巴囊中的具体作用机制，将人内淋巴囊组织培养物中加入ADH，发现AQP2从内淋巴囊的腔侧移位到基底外侧膜侧，并且V2受体拮抗剂能逆转上述移位，使AQP2再次转移到腔侧。作者推断ADH升高和随后的V2-AQP2激活，可导致水进入内淋巴腔内，这可能是MD发病重要的病理基础，这可能为MD患者的治疗带来新思路。

上述研究显示内淋巴囊有AQP2和V2受体表达，并且ADH作用于V2受体和AQP2可能影响内淋巴液的稳态，从而导致MD的发生和发展，但调节内耳液体穿过内淋巴囊上皮的分子机制尚不清楚。2017年，Runggaldier[13]等在上述研究的基础上做了进一步研究。他认为除V2-AQP2途径激活外，还可能与细胞间通透性和屏障特性的改变相关，其由内淋巴管和内淋巴囊中被称为紧密连接(tight junction，TJ)的细胞-细胞接触控制。在紧密连接处，相邻细胞顶端区域通过一系列密封链连接，密封链由密蛋白家族(Claudin)成员和相关蛋白质组成,它们分别被认为是屏障或成孔分子，由于不同的密蛋白涉及增加或降低TJ的密封强度，因此，密蛋白组合的表达决定了上皮细胞层的细胞旁通透性。Runggaldier通过高通量PCR和免疫荧光共聚焦显微镜证实，大鼠内淋巴管和内淋巴囊的上皮存在TJ蛋白 Claudin 3、4、6、7、8、10 和 16 的特异性表达。Runggaldier等用V2受体激动剂ADH类似物（1-脱氨基-8-D-精氨酸-加压素-dDAVP）处理内淋巴囊上皮细胞培养物，发现内淋巴囊和内淋巴管基底外侧膜相对于细胞质中Claudin 4显著增加，推测Claudin 4由上皮细胞的细胞质转移到基底外侧膜中。作者认为ADH可通过调节内淋巴囊上皮细胞的细胞旁屏障来调节内淋巴的液体和离子稳态。

综上所述，ADH可通过激活V2-AQP2调节内淋巴囊上皮对水的通透性从而导致内淋巴积水，还可改变细胞间通透性和屏障特性调节内淋巴渗透压，当ADH浓度升高时，可导致膜迷路积水，产生类似MD临床表现，这一点已经通过动物实验以及临床观察得到了证实，由此可以推断MD患者病情变化可能与血浆ADH水平的变化有关，但ADH作用于内耳的机制尚不明了，仍需进一步研究。

2 肾上腺皮质激素与MD的关系

肾上腺皮质由外向内依次分为球状带、束状带和网状带。醛固酮为盐皮质激（mineralocorticoid，MC）代表，由球状带分泌。糖皮质激素（glucocorticoid，GC）由束状带分泌，其中90%为皮质醇，10%为皮质酮，且95%的GC效应来源于皮质醇[6]，可认为糖皮质激素对内耳影响主要由皮质醇发挥作用机制[14]。

2.1 醛固酮与MD的关系

醛固酮是一种类固醇类激素，主要作用于肾脏进行钠离子及水分子的再吸收。内淋巴积水作为MD的基本病理组织学基础已经被普遍接受，有学者推测，醛固酮可能也参与了膜迷路积水的发生。

2015年，蒋子栋等[7]将20只豚鼠连续7天腹腔注射醛固酮，剂量为100μg/0.1kg，每日一次，取存活豚鼠的颞骨分别进行火棉胶和冰冻切片，光学显微镜观察发现，醛固酮诱导膜迷路积水成功率89.4%（17/19），差异有统计学意义(P＜0.05)。研究结果表明给予外源醛固酮可以导致豚鼠内淋巴积水，再次验证了其2002年的实验结果[15]。

对肾脏、结肠等组织的研究表明，醛固酮可调节肾小管上皮细胞、结肠上皮细胞表面的钠离子通道(epithelial sodium channel，ENaC)，进而调节机体对Na+、K+等电解质的吸收与分泌，从而维持机体内环境的稳定[6]。内耳的内淋巴液为高钾(160 mmol／L)低钠 (1.5 mmol／L)液体，其离子浓度与细胞内液相似[16]，钾和钠代谢的不平衡可能干扰耳蜗和前庭中感觉毛细胞的功能、内耳蜗电位（EP）的产生以及内耳水的代谢[17]，从而引发某些内耳疾病，例如MD，其病理学基础就是由于内淋巴分泌与重吸收失衡而导致的内淋巴积水。2014年，Zhong等[18]选取10只体重300-500g的成年豚鼠，取其颞骨切片行免疫组化检查,观察ENaC。ENaC有三个亚基，α-,β-和 γ-,本实验结果显示，ENaC广泛分布在耳蜗组织中，其中α-ENaC主要分布在螺旋缘，β-ENaC和γ-ENaC分布在螺旋韧带、螺旋缘、Corti器和螺旋神经节中。由此可以推测，醛固酮在内耳通过ENaC发挥作用，实现其对内淋巴液成分和渗透压的调节，最终改变内淋巴的压力和电化学平衡。2017年，Mori等[19]提出了与上述相同的观点，并提出了内淋巴囊对袢利尿剂不太敏感，而对醛固酮拮抗剂更敏感，说明醛固酮对内淋巴囊有很强的作用。

2016年，秦丽等[20]将28只豚鼠随机分为两组，对照组注射50μl生理盐水，实验组腹腔注射0.1mg/kg/d醛固酮，各注射5天。1个月后检查听性脑干反应(auditory brain stem response，ABR)，观察耳蜗功能变化；应用HE染色检测两组耳蜗组织形态学差异，利用免疫组织化学检测AF9（the putative transcription factor ALL1-fused gene from chromosome 9，AF9转录因子9）蛋白在耳蜗组织中的定位表达以及醛固酮作用前后AF9蛋白的不同表达模式。结果显示实验组ABR阈值较对照组升高(P＜0.05)。HE染色证实实验组豚鼠耳蜗存在内淋巴积水，免疫组化发现AF9蛋白在血管纹、前庭膜、螺旋器、螺旋神经节及前庭膜均有表达，并且实验组耳蜗AF9蛋白在血管纹及前庭膜表达量低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。作者推测耳蜗组织中存在与Na+代谢相关的AF9蛋白，醛固酮可能通过下调AF9蛋白表达来参与内淋巴代谢，进而影响内耳功能。

但是，也有临床观察结果与上述研究的观点不一致。2017年，Miyashita等[21]将13名MD患者分为两组，第1组（n=7）Na+摄入量≤3克/天，第2组（n=6）Na+摄入量＞3克/天。两年后第1组的眩晕控制率和听力水平均比第2组更好，这表明低盐饮食是控制MD症状的有效措施。分别检测两组患者血浆醛固酮水平，结果显示第1组血浆醛固酮水平高于第2组，Miyashita推断低盐饮食可以诱导血浆醛固酮水平的增加，其可以激活离子转运促进内淋巴囊中的内淋巴液吸收，但具体作用机制未阐述。此结果与我们所知的动物实验结果相反，推测其原因一方面可能是限制Na+摄入，血Na+浓度降低可以直接刺激醛固酮分泌[6]，故测得血液中醛固酮水平升高。另一方面，可能是动物模型研究数量较多，可控性好，而临床研究受试者数量少，分期不详，可控性差，因而导致上述结果。根据醛固酮生理功能推测，更倾向于醛固酮水平升高引起膜迷路积水，产生MD的临床表现。

综上，醛固酮在MD发作前、发作期及缓解期发挥什么作用以及怎样发挥作用，仍需要进一步研究。

2.2 GC与MD的关系

GC是由肾上腺皮质分泌的一种机体内极为重要的一类调节分子，是临床上使用最为广泛而有效的抗炎和免疫抑制剂。可以预防和阻止免疫性炎症反应的发生，对任何类型的变态反应性疾病几乎都有效。目前GC广泛应用于自身免疫性内耳病、突发性聋、MD等内耳疾病的治疗[22,23]，认为GC在细胞水平与受体结合，激活的受体转移至细胞核内调节基因的表达，从而在靶器官发挥生物学效应。组织对GC的反应主要取决于组织中糖皮质激素受体(glueoeortieoid receptor，GR)的含量[24]。GR 在内耳的神经性和非神经性组织中均有分布，且具有分布不均衡的特点。Kim等[25]证实GR存在于Reissner’s膜、球囊上皮和半规管上皮的原代培养物中，GC与GR结合，活化的GR通过糖皮质激素诱导激酶1（serum and glucocorticoid-regulated kinase 1，SGK1）调节途径增加细胞表面的ENaC表达。

钠钾泵（也称Na+，K+-ATPase）是哺乳动物细胞膜中普遍存在的离子泵，可实现钠离子和钾离子之间的逆浓度差交换，从而保持胞质的高钾、胞外高钠的不均匀离子分布，钠钾泵对调节人体体液和电解质的平衡有很重要的作用。前庭阶的钠钾泵把K+从血管纹的边缘细胞泵入内淋巴，从而使内淋巴保持高K+状态，继而维持耳蜗内淋巴的平衡，这有赖于钠钾泵的数量及功能状态[26]。Kim等[27]还观察到地塞米松不仅可以增加钠钾泵数量，还可上调其通道的活性。Kim等[28]指出，在Reissner膜中存在无赖氨酸激酶(with no lysine kinase，WNK)四种亚型，WNK是一种蛋白激酶，在一些细胞中被SGK1磷酸化，增加Na+的转运，其中WNK4与地塞米松特异性结合发挥其生物学效应。尽管GC通过ENaC增强Na+吸收[29]，但其作用的分子机制尚未明确。国外学者对16名MD患者进行鼓室内注射甲基强的松龙治疗，并进行了2年的回顾性研究。治疗方法为患者每日一次，连续10天。2年内完全眩晕控制者13/16例(81%)[30]。已知MD的病理基础是膜迷路积水，离子通道功能异常，因此推测GC治疗的有效性可能是使Reissner’s膜、球囊和半规管上皮对内淋巴液中Na+转运增加所致。

2014年Nevoux等[31]在小鼠内耳细胞的培养基中加入GC，导致AQP3 mRNA表达显著增加，约为正常值3倍，这一结果提示小鼠AQP3基因的转录可能被激活，推测GC增强人内耳中AQP3的表达，增加内淋巴中水重吸收。Kitahara等[32]解剖大鼠颞骨，暴露内淋巴囊和内淋巴管，实验组将地塞米松明胶海绵放置到内淋巴囊周围，对照组将盐水明胶海绵放置到内淋巴囊周围，结果发现实验组AQP3 mRNA水平提高。2019年zou[33]将含甲基泼尼松龙的明胶海绵，放置在MD患者的ES表面，手术后2个月纯音听阈，所有频率均得到改善，在0.5、1、2 kHz平均提升15 dB，并且术后5个月的随访未出现眩晕发作，但其主要作用机制未阐述。通过上述文献复习，推测GC在动物和人类内耳可能通过调节ENaC和AQP3来调节内耳液体平衡，但具体的机制尚不清楚。

综上所述，内耳中存在多种激素受体，在未来的研究中，尚需进进行大量研究了解MD患者外周血中抗利尿激素、醛固酮及糖皮质激素浓度变化及其对临床症状发生发展的影响，从而推动MD的发病机制研究与治疗。