基因编辑技术在人参中的应用展望

王琪，张浩，王博文，雷秀娟，王英平,※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；2.吉林农业大学，吉林 长春 130118）

基因编辑技术是近几年蓬勃发展的一项新型生物技术，不同于传统转基因技术的随机性与不确定性，该技术能对基因组进行定点修饰。在特定位置断裂核酸分子后，基于细胞的自我修复机制，以非同源末端修复和同源重组途径实现碱基的缺失、替换，基因的敲除、敲入等进而达到对基因的编辑目的[1]。基因编辑技术自问世以来已广泛应用于各类基础研究和生产应用，如基因组功能研究、动植物育种、基因治疗和遗传性状改良等领域且成果显著。目前基因编辑技术已在模式植物和农作物中发挥了巨大的作用，体系日渐成熟和完善，但药用植物道地性强、数量相对稀少和研究范围较窄的现状在一定程度上制约了基因编辑技术在药用植物领域的应用和发展[2]。药用植物基因编辑体系的建立必定是一个较为漫长且艰难的历程。

人参是药用植物家族中的重要一员，被誉为“百草之王”，喜阴凉湿润的环境，主要分布在我国东北三省，同时也在朝鲜北部、日本中北部和韩国中部等临近中国的山区地带有所分布[3]。人参具有补气安神、益肺益智、大补元气和补脾生津等功效[4]，除了因极具药用价值而得到医学药学界的认可外，人参还被应用于保健和药妆等领域。但目前仍有许多因素限制着人参产业的进一步发展，如人参道地性强，对生存环境要求严格；生长年限长，易遭受病虫害；主要有效成分人参皂苷在植物本体内的含量并不高且难以达到大规模的产业化等。随着分子生物学手段的不断更新和完善，越来越多的研究人员致力于从基因层面对物种进行直接调控。虽然目前对人参基因组的研究不够全面和深入，但基因编辑技术可以推进药用植物基因组的功能研究，反之人参基因功能研究的完善也会加快基因编辑技术在人参中的发展。建立起人参基因编辑的相关体系，将对人参的遗传分析、种质创新和品质改良具有重大意义。

1 基因编辑技术

基因编辑技术的发展主要经历了人工核酸酶介导的锌指核酸酶（ZFN）技术、类转录激活因子核酸酶（TALEN）技术和规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）技术。它们能特异性地识别靶位点，对其单链或双链进行精准切割造成链的断裂，启动生物体的内源性修复机制来完成对靶标基因的敲除乃至替换。尤其是CRISPR/Cas 系统以其灵活的试验设计、低成本和短周期迅速引领了基因编辑的潮流，同时科研人员进行了大量基于CRISPR/Cas9 的技术优化以期实现更高效的基因编辑。

1.1 锌指核酸酶（ZFN）技术

锌指蛋白是1983 年在非洲爪蟾的TFA 家族中发现的一类转录因子。每个锌指蛋白可以特异性地识别DNA 链上的3 个连续碱基，把3～6 个锌指蛋白串联成结构域，便可识别更多的碱基及序列[5]，且具有较高的特异性。FokI 是在海床黄杆菌中发现的一类限制性内切酶，只有在形成二聚体的前提下才能发挥其切割作用。1996 年，Kim 和Cha 两位科学家将锌指结构与FokI 的酶解中心串联起来，得到了锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）[6]，经人工改造后能够实现基因的定点编辑。把锌指蛋白结构域和不同的酶、转录因子相结合就能形成具有特异性功能的蛋白复合体，发挥不同的作用。目前已经得到广泛应用的有锌指核酸甲基化酶（ZFM）、锌指激活因子（ZFA）、锌指抑制因子（ZFR）以及锌指核酸酶（ZFN）等[7]。ZFN 介导的基因编辑技术已得到广泛应用。Osakabe 等[8]用锌指核酸酶对拟南芥ABI4 基因进行编辑，所获得的纯和植株对葡萄糖、脱落酸的敏感度降低；Li 等[9]通过ZFN 对B型小鼠进行基因编辑治愈了血友病并获得具遗传性状的个体；Cai 等[10]利用ZFN 对烟草CHN50 基因进行编辑，启动细胞内的同源重组修复途径，成功将外源基因PAT 整合到靶序列中。

1.2 类转录激活因子核酸酶（TALENs）技术

类转录激活因子效应物（transcription activator-like effector,TALE）是在植物病原菌黄单胞菌属（Xanthomonas）中首先被发现的一种相对保守的菌体蛋白[8]，由其T3S（type secretion system）分泌，侵染细胞后可以特异性地识别植物的DNA 序列[11]，模拟宿主行为激活靶基因的转录并从基因层面对植株进行调控。TALE 蛋白DNA 结构域第12 和13 位的氨基酸协同作用组成一个识别单元（repeat variable diresidues，RVD），每个RVD能特异性识别某种碱基[12]。研究人员把TALE 的识别结合域和FokI 的DNA 切割域相互融合，成功构造出能识别并切割DNA 双链的特异性核酸内切酶（TALENs）。TALENs 在植物育种、基因治疗和遗传改良等领域皆取得了显著成效。Shan 等[13]通过该技术对控制水稻香味的OsBADH2 基因进行敲除获得了香味株系并在此基础上成功培育了香稻品种；Bacman 等[14]利用TALENs 成功实现线粒体的基因编辑，为线粒体病的基因治疗开辟了新途径；Haun 等[15]对调控大豆脂肪酸的FAD2-1a、FAD2-1b基因进行敲除，去脂肪酸饱和酶表达量大幅减少，大豆饱和油含量增高，延长了大豆的保存时间。

1.3 归巢核酸酶技术

归巢核酸酶是一种稀有的大范围核酸内切酶，能够识别其他内切酶所不及的长DNA 序列，特异性识别的切割位点也较大（通常大于14 bp），因此脱靶效率极低。但是天然存在的归巢核酸酶的位点极少，可利用率和突变率不高。且该酶只有一个结构域，DNA 结构发生的微小改变就可能导致切割失败。归巢核酸酶的设计难度很大，对技术要求严苛，不宜进行人工改造，因而该技术难以在基因编辑领域广泛使用[16]。由于归巢核酸酶的高特异性，在人类基因组中发生解理的频率低，可以作为具有高针对性的分子剪刀靶向于特定的基因达到基因治疗的目的。Redondo 等[17]设计改造的归巢核酸内切酶有可能修复在“着色性干皮肤”中发生突变的基因。

1.4 规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）技术

CRISPR即规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）。1987 年Ishino 等[18]首次在大肠埃希菌中发现该重复序列；2005 年，CPISPR 技术的研究有了重大进展，科学家们发现被侵染细菌的CRISPR 中，其间隔序列和入侵它们的病毒噬菌体部分核酸链有着高度同源性，进而推测CPISPR 与细菌免疫存在必然联系[19]。2007 年，Barrangou 等[20]发现嗜热链球菌以CRISPR/Cas系统成功抵抗噬菌体的入侵。噬菌体首次侵入细菌时，其序列片段会被Cas 蛋白编码的酶切割下来并整合到CRISPR 的重复序列间，赋予细菌获得性免疫的功能，如果同一噬菌体再次入侵便能被细菌识别并直接切割，至此基于CPISPR的免疫机制更加明确。CRISPR/Cas系统是原核生物所特有的用来抵抗病毒感染的免疫系统。该系统的基因座包括3个部分，5'端的tracrRNA 基因、中间的Cas 蛋白编码区以及3'端的CRISPR 基因座。II 型系统存在于大多数细菌中，是在Cas9 蛋白存在的前提下引起细胞免疫降解噬菌体或外源DNA，结构较简单，便于改造利用，只需要人工合成一条gRNA即可实现对基因的特异性修饰，因此备受青睐。刘婷婷等[21]对毛白杨中的内源基因八氢番茄红素脱氢酶进行敲除，获得多个突变体株系；胡春华等[22]针对香蕉的MaPDS 基因成功构建了MaPDS 编辑载体，以农杆菌转化法成功转入植物体并经一系列筛选培养最终获得具抗性的独立转化株系；禹明森等[23]根据生菜FANCM 基因建立了生菜的CRISPR/Cas9 基因编辑体系，为培育更具优势性状的新品种奠定了基础；周岩等[24]基于CRISPR 以基因枪转化法对非香型粳稻品种“吉粳88”进行基因编辑并成功获得纯合的子一代；奉宝兵等[25]利用CRISPR/Cas9 技术对脱支酶基因进行定点编辑获得了等位变异的遗传材料；王金彪等[26]通过农杆菌转化法对甘蓝型油菜的BnaLCR78基因实现了定点敲除，为后续的基因功能研究奠定了基础。

基因编辑效率受载体类型、材料状态和转化体系等多种综合因素的影响，编辑效率偏低和容易脱靶等仍是编辑过程中的难题。在原有基础上对基因编辑的体系进行优化是主要任务之一。统计发现sgRNA 3'端第20 位碱基为G 或第16 位碱基为C 时编辑效率相对较高[27]，但这些结论往往是经过大量试验和数据归纳得到，具体作用机制并不明确，因此要得到特异性高的sgRNA不仅需要理论知识的铺垫，还要进行大量重复试验才能优中选优。一种氨基酸可由多个密码子编码，但环境、遗传和进化等多因素影响让不同物种有各自的密码子偏好性，sgRNA与物种的密码子偏好性一致可能会提高基因编辑的效率，如果根据物种的偏好性对Cas9 的蛋白进行改造优化，Cas9 在生物体内的表达活性可能较高。例如，禾本科植物基因组中G 和C含量较高，可以据此提高Cas9 蛋白密码子的C 和G含量去适应该物种的密码子偏好性；以人类基因密码子优化的Cas9 在水稻中表达量和突变率都很低，而基于水稻密码子优化的Cas9 蛋白靶向同一序列，突变效率显著提高；同一启动子在不同物种或不同启动子在同一物种内的表达效率皆有所差异，在选择启动子时可以借鉴其他物种编辑成功的案例。基因编辑体系初步建立时，可以同期构建不同启动子驱动的载体，根据试验结果选择最适合该物种的启动子；也可以通过启动子的串联，增加启动子个数以增加驱动能力，提高表达效率。未经改造的野生型Cas9 蛋白能切割双链DNA形成DSB，人为地将Cas9 蛋白的某个结构域失活使其成为Cas9 nickase（nCas9），该蛋白就只具有单链切割活性产生SSB（single-strand breaks），此时细胞会以高保真的碱基切除方式进行修复，也可以降低脱靶效率[28]。如果将2 个结构域都失活形成Dead Cas9（dCas9），Cas9 将不具有核酸酶活性，但仍可以在gRNA 引导下与靶序列结合发挥转录因子的作用，促进或抑制基因的表达；Cpf1 是单链crRNA 介导的一种核酸内切酶，Cas9 更具优势：Cpf1 分子量小，更容易被导入细胞，Cas9在两条链的相同位置进行切割产生平末端，有利于细胞启动NHEJ 修复途径。而Cpf1 在双链的不同位置进行切割产生黏性末端，有利于细胞启动HR 修复途径，更适用于基因敲入。Cas9 的切割位点临近PAM序列，但Cpf1 切割位点距离识别的序列较远，扩大了靶基因的范围，编辑位点多样性增加。Cpf1脱靶效率低，且具有双重活性，能切割DNA 和RNA[29]。

2 基因编辑技术在人参中的应用

2.1 推进人参基因组学研究

研究物种的基因组是分子生物学的重要任务之一，对基因组结构、定位和功能的分析能揭示物种生长发育的规律，从根本上探寻不同个体间的差异和共性。研究基因功能的方法有很多种，如基因敲除、基因克隆、反义RNA 和RNAi 等。陈超等[30]从人参叶片中克隆了PgAGO1 基因并进行生信分析，提取人参不同部位的RNA，通过qRT-PCR 技术检测所克隆的基因在人参不同部位的表达情况，发现该基因在人参花中的表达量高，在根中的表达量较低，为PgAGO1 基因在人参基因组中的功能研究奠定了基础。梁彦龙等[31]基于反义RNA 技术构建了人参环阿屯醇合酶（CAS）基因的反义表达载体，抑制了甾醇的合成途径，使前体物质氧化角鲨烯更多地流向皂苷合成，获得了皂苷含量相对较高而甾醇含量较低的发根系，明确了CAS基因在人参代谢中的途径以及该基因在人参皂苷合成中的调控作用。曹豪杰等[32]利用RNAi 技术干扰-香树素合酶（ -AS）基因的表达，以期抑制齐墩果烷型皂苷（Ro）的代谢通路，使更多的前体物质流向合成达玛烷型皂苷的途径，试验成功降低了Ro 在人参发根中的含量，验证了 -AS 基因在人参皂苷合成中的功能并为研究人参皂苷的合成机制提供了依据。基因编辑技术的问世给基因功能的探究提供了新的思路和方法，基因编辑技术不但能从DNA 水平上对基因进行调控，还实现了基因的定点敲入、敲除乃至单碱基替换等，从根本上改变基因的表达，进而通过蛋白质种类、结构的改变和性状的差异分析基因功能，以反向遗传学的思路对基因组进行研究，再辅以基因测序和互补试验等手段对该基因的功能进行多方面验证。王浩等[33]构建了CRISPR/Cas9 基因编辑敲除载体靶向矮牵牛的miR l59a 和miRl59b 基因，miRl59b 缺失的突变体材料与野生型矮牵牛相比，叶片数在现蕾期增多，叶面积增大，开花延迟，植株变高，研究补充了miR159 基因家族对于植物观赏性状的作用。如果建立起人参基因编辑的体系，就能对人参的基因组进行更全面深入的补充，而人参基因组的深入研究能为基因编辑目的基因提供多方位的选择。

2.2 调控皂苷合成

对药用植物来说，提高其有效成分的含量具有深远意义。随着分子生物学的发展，越来越多的研究开始从基因层面对生物合成和代谢通路进行调控。贠小芸等[34]基于酿酒酵母三萜类化合物合成路径，利用CRISPR-Cas9 技术增加-香树脂醇上游主路关键酶基因的表达量并减少支路中关键基因的拷贝数调控前体物质的流向，获得了-amyrin 产量较高的酵母工程菌。人参化学成分多样，人参皂苷是人参主要的活性成分之一，是由苷元和糖相连而成的糖苷类化合物，具有抑癌抗癌、免疫调节[35]和抗氧化等功效。但皂苷在人参中的含量较低且不宜分离。通过种植量的扩大或提取工艺的优化只能在一定程度上缓解这一现状，并不能从根源上解决问题。目前，越来越多的研究人员对皂苷的合成和代谢途径进行了深入研究，挖掘皂苷合成途径中的关键基因，并利用现代生物技术手段从基因层面进行调控进而影响人参皂苷的合成，达到提高人参皂苷产量的目的。若以人参皂苷合成途径中的主调控基因作为靶向基因，增加主路基因的表达量或抑制、阻断支路基因的表达，有望从基因层面实现对皂苷合成的调控。如敲除人参环阿屯醇合酶（CAS）基因，使人参皂苷的前体物质氧化角鲨烯更多地流向合成皂苷的路径。以基因编辑的方式对人参代谢过程中的基因进行调控，有望实现人参特异化和产量化。

2.3 推进人参分子育种

传统的育种工作经常围绕系统育种、杂交育种和诱变育种展开。这些育种方式往往存在过程繁琐和工作量大且育种结果不确定等问题，基于分子生物学的新型育种方式令这一现状有所改观。转基因育种技术曾备受关注，但该技术常因插入位点的不确定导致育种失败甚至产生对人不利的结果。基因编辑技术不但可以实现基因组定点改造和定向育种，在较短育种周期内培育出产量高品质优良的品种，而且该技术只是对基因起到编辑的作用，与自然变异无本质差别，后期可以筛选出只有目标基因突变的材料且Cas9 和载体等不会遗传到子代，大大减少了外源基因的污染，基因编辑已经迅速引领了新一代育种工作的潮流。Khanday等[36]采用CRISPR/Cas9 敲除了BBM 基因，终止了卵细胞的减数分裂行为并使水稻胚胎终止发育，为物种的无性繁殖开辟了道路。矮秆品种的选育是主要的育种目标之一，水稻SD1 等位基因功能的缺失会获得半矮秆的表型。胡雪娇等[37]敲除了水稻SD1 基因并获得了纯合突变体，其株高较野生型下降了25% 左右，为水稻的育种工作提供了极大便利。人参的栽培历史短，品种资源匮乏，育种周期长。人参一般五年生留种，且结实数量少，即便获得性状优良的遗传变异类型，也会因各种条件限制难以推广。目前人参的分子育种工作还没有得到深入展开，如果将基因编辑技术应用到人参辅助育种工作中，有望缩短其育种年限，培育出性状优良、高产高抗的新型人参品种。

2.4 提高人参抗性

人参生长年限长，道地性强，对生长环境要求严格。目前人参的抗逆抗病机制并不完善且缺乏相应的品系，大大制约了人参产量和品质的发展。如病虫害等仍是影响人参生长发育、减少其经济价值的不利因素，施加大量的化学制剂虽能短时间改善这种现状，但随着病原生物耐药性的增加会适得其反，其药物残留不仅打破了种植地生态系统的平衡，也危害了人类健康。结合分子生物学手段选育抗性品种能从根本上增加植物抵抗不利环境的能力，也一定程度上缓解了病虫害的困扰。基因编辑技术问世以来在植物育种工作上得到了广泛应用并取得了一定成效，也克服了传统转基因技术存在的位点不确定和转化效率低等问题。雷建峰等[38]构建了CRISPR/Cas9 载体敲除野生拟南芥的抗旱负调控基因GGB，突变体较野生型失水率降低，抗旱性增加但材料的正常生长发育未受影响，为植物的抗逆研究提供了思路，同时为不同植物GGB 同源基因的研究奠定了基础。徐鹏等[39]针对稻瘟病的抗感差异基因Pita、隐形状态下的抗稻瘟病菌基因Pi21 和稻瘟病抗性负调控基因ERF922，利用CRISPR/Cas9系统对其进行定点编辑并获得了不同突变类型的材料，对纯合突变的幼苗进行稻瘟接种鉴定，发现其防卫基因的表达量增加，对稻瘟病的抗性增加。初旸等[40]参照人参全基因组利用生信分析预测了人参7个家族的1 652 个抗病基因并分析其进化关系和结构特点，为人参抗性分子育种提供了借鉴。物种之间虽然存在差异，但也存在大量的同源基因，基因组较为完善的模式植物和常见植物种能为人参抗性基因的研究提供参考。利用基因编辑技术的定向性将抗性基因整合到人参的基因组中，或者敲除对人参抗性的负调控基因，能从根本上提高人参的抗性，开辟人参品质改良的新途径。

3 结语与展望

基因编辑技术自问世以来创造了一个又一个令人瞩目的研究成果，得到了无数科研工作者的青睐。尽管目前以CRISPR/Cas9 技术为主的基因编辑系统仍存在一些技术上的难题，但随着研究的深入和经验的积累这些难题终将被攻克。如果实现该技术在人参相关领域的应用，对人参的遗传育种、品质改良以及基因功能研究将具有深远意义。虽然人参基因组序列保守性很高，突变和重组率都很低，但与常见的农作物和模式植物相比，人参的基因组学和分子生物学研究基础十分薄弱且范围较窄，既没有完善的基因组数据，又缺乏有效的遗传转化体系。尽管对人参进行基因编辑并建立完善体系的难度较大，但基因编辑技术已经得到广泛应用，技术手段也在不断更新和进步，这为人参基因编辑体系的建立提供了充足的理论知识和可借鉴的经验，因而实现基因编辑技术在人参这种药用植物上的应用，并逐步建立成熟的基因编辑体系指日可待，人们也可以从基因层面重新定位和审视人参这种药用植物。