儿童结核病的实验室诊断现状与进展

吕纯阳 罗晶晶 石华 李明远 江咏梅

根据WHO[1]最新公布的全球结核病报告，2018年全球14岁以下新发结核病患者约112万例，占全年龄段新发患者例数的11.2%；全球17.3万例患儿因结核病而死亡。我国作为结核病高发国家，据2018年最新报告显示，新发结核病患者80万例，其中儿童仅占1%，与估算结果相差较大[1]，主要原因是诊断和报告严重不足。儿童结核病常与其他常见儿童疾病有重叠，临床表现和影像学特征常为非特异，且容易变化，因此实验室检查常是儿童结核病诊断的重要部分。与成人相比，儿童患者的标本采集较困难，且通常菌量较少，使得成人实验室结核检测方法在小儿患者的应用中缺乏敏感度。其次，儿童结核分枝杆菌感染易进展为活动性结核病，甚至是全身播散性结核病等严重感染，预后不佳。另外，儿童耐药结核病的防治也是近年来关注的话题，早期规范的治疗可以取得较好的疗效和预后。所以及时准确的实验室诊断结果对儿童结核病治疗、改善儿童结核病的预后具有重要的意义。基于儿童结核病上述特点，其实验室检测选用的标本、方法和策略与成人不尽相同，笔者对儿童结核病实验室诊断现有方法和新的进展进行综述。

病原学方法

一、标本采集与处理

细菌病原学检查被认为是结核病的确诊依据，如组织活检、涂片检查和分枝杆菌培养。《WS 288—2017肺结核诊断》规定，病原学确诊肺结核需至少2份标本(涂片、组织学或培养)阳性，儿童结核病诊断应重视胃液病原学检查[2]，WHO则推荐2份病原学标本应在就诊的同一天留取[3]。由于儿童标本中细菌负荷低且难以收集，上述方法在儿童中效果不佳，呼吸道标本涂片检查的敏感度仅为17.1%～26.3%，其他体液标本涂片检查结果几乎为阴性[4-6]。若要提高细菌学检查的敏感度，有研究者建议可使用多重取样方法进行微生物诊断，包括连续收集生物样本，如胃吸出物(GA)、鼻咽吸出物、痰液、支气管肺泡灌洗液(BAL)，以及淋巴结吸出物、活组织检查标本、脑脊液和尿液等[7]，并已有研究表明GA和BAL检测相结合可以提高肺结核患儿的细菌学检出率[8]。对于结核性脑膜炎等需要抽取脑脊液、浆膜腔积液的儿童常见肺外结核，吕翠环等[9]通过甩片离心法进行细菌的富集，可明显提高涂片镜检的检出率。

二、结核分枝杆菌培养

粪便、呼吸道标本、胃液等是儿童结核病实验室诊断中常用的标本，但培养的阳性率也仅为24%、20%、25%～60%[6, 10-11]。结核分枝杆菌培养中，改良罗氏培养法耗时过长，一般需要4～8周，不利于早期发现结核病患者。美国研制的BACTEC MGIT 960分枝杆菌全自动液体培养系统，操作简单，费用较低，与改良罗氏培养法符合率高，适合标本负载量大的实验室或基层结核病防治机构应用[12]。总体来说，培养法的特异度非常高，但仍需要做好实验室质量控制，提高检测水平尤其是敏感度[13]。Parashar等[14]使用儿童胃液标本进行液体培养，其阳性率为21.5%，并建议在培养时不中和胃液，还可提高检出率。白永凤等[15]用该技术在涂片阴性的肺结核标本中进行检测，其痰液培养结果与GeneXpert MTB/RIF(GeneXpert)敏感度差异无统计学意义，液体培养报阳平均耗时13.7 d，与传统方法相比已大大缩短检查时间。

分子生物学方法

一、结核分枝杆菌核酸检测

最早用于儿童结核病核酸检测方法的是聚合酶链式反应(PCR)，一般通过扩增结核分枝杆菌插入元件IS6110进行诊断。结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时检测技术(SAT-TB)则以结核分枝杆菌16S rRNA为靶标，经恒温RNA扩增技术和荧光探针杂交，对荧光信号进行实时监测。Nicol等[16]使用口腔拭子进行PCR检测，其敏感度为43%，特异度为93%，比采用痰标本进行GeneXpert检测的敏感度(64%)低；在疑似结核病的儿童中，PCR检测的敏感度为31%，特异度为93%，比采用痰标本进行GeneXpert检测的敏感度(21%)高。SAT-TB较少用于儿童结核病诊断，但在少痰肺结核标本中，此方法的敏感度、特异度分别为50.75%和94.73%[17]。此外，PCR对于骨关节结核、脊柱结核的早期快速诊断方面明显优于镜检法和培养法，标本可来源于窦道分泌物、活检组织等[18]。《WS 288—2017 肺结核诊断》[2]指出，分子生物学方法诊断结核病，在结核分枝杆菌核酸检测结果为阳性的同时，具有任一影像学改变特征才可确诊。核酸检测在儿童胃液(81.51%)、诱导痰(47.62%)等载菌量较高的标本中敏感度均高于自然排痰的涂片及培养结果，且获取结果快(2 d以内)，在儿童结核病检测中具有较大的优势[19]。由此可见，在涂片、培养等结果阴性或结果等待时，可用该法对胃液等载菌量较高标本进行快速检测，对提示诊断有一定作用。

二、GeneXpert检测

GeneXpert是利用分子信标技术建立的检测方法，自动、封闭扩增结核分枝杆菌rpoB基因的81 bp核心区域，可直接检测结核分枝杆菌及其利福平耐药性，2 h内即可得到检测结果。GeneXpert被WHO推荐用于使用脑脊液、淋巴结或其他组织学标本诊断肺外结核，并建议在怀疑患有肺结核的儿童中，将呼吸道标本的GeneXpert结果用作初始诊断[20]。2018年，印度进行了一项比较研究，GeneXpert在所有临床诊断的结核病患儿中敏感度为58.5%(呼吸道标本)，对培养阳性的患儿检测的敏感度为81.8%[21]。Rachow 等[22]报道，在未取得培养证实的临床结核病儿童中，GeneXpert的阳性率仅8.5%，于是对于儿童患者需进行多次取样(不计标本类型)来提高检出率。GeneXpert在粪便标本中检测的敏感度和特异度分别为67%和99%[23]，以胃液为标本敏感度则能达到80%以上，在涂片培养均阳性的标本中甚至达到96.7%[24]。另外，以培养为金标准，GeneXpert检测淋巴结活检标本和脑脊液标本的敏感度均在80%以上，相比于培养PCR检测有明显优势，这对于儿童较为常见的肺外结核，如结核性淋巴结炎、结核性脑膜炎等的诊断是有益的[25]。GeneXpert的另一个作用是检测利福平耐药基因，而利福平耐药通常可提示异烟肼或其他二线药品的耐药情况。与成人不同，儿童耐药结核病若得到及时规范的治疗，大多可以获得较好的效果。在印度的一项儿童研究中[26]，GeneXpert检测出利福平耐药的敏感度为72.7%，避免了经验用药导致的更多耐药菌的出现。GeneXpert检测费用较表型药敏试验低，且报告时间快，生物安全要求低，特别适合在我国儿童医院中推广使用。

Xpert MTB/RIF Ultra 是在8个中、低收入国家中进行多中心研究后，于2017年推出的第二代检测方法。与第一代相比其检测盒用于DNA扩增的腔室增大，且增加了两种结核分枝杆菌检测分子靶点，其检测下限为第一代的1/8(<15 CFU/ml vs 100～120 CFU/ml)，报阳、报阴时间也分别由原来的110 min缩短到77 min、66 min。Nicol等[27]对儿童痰标本的研究结果显示，在76例细菌学证实的结核病患儿中，GeneXpert检测的敏感度为63%，而Xpert MTB/RIF Ultra检测的敏感度为74%。2019年的另一项儿童研究结果表明，与培养相比Xpert MTB/RIF Ultra检测鼻咽抽吸物的敏感度和特异度分别为46%和98%，诱导痰的敏感度和特异度分别为74.3%和96.9%。而将鼻咽抽吸物和诱导痰组合可将敏感度提高至80%[28]。Xpert MTB/RIF Ultra对肺外结核标本、无创标本、粪便标本等的检测具有积极意义。目前，WHO推荐的GeneXpert临床应用范围也适用于Xpert MTB/RIF Ultra，可在所有具有结核症状的成年人和儿童中作初始诊断，以及特殊的肺外标本(脑脊液、淋巴结和组织活检标本)中检测结核分枝杆菌[29]；但Xpert MTB/RIF Ultra 未被WHO推荐在尿液、粪便、血液等标本中应用[30]。在利福平耐药检测方面，Meta分析结果显示[31]，Xpert MTB/RIF Ultra具有与GeneXpert相近的敏感度。

另外，仍需要研究评估GeneXpert对儿童结核病诊断、经验治疗、预后的影响程度。Rachow等[22]在研究中指出，若等待培养结果，有56.25%的感染儿童会因最初涂片阴性，在就诊15～59 d后才能得到治疗；若将GeneXpert阳性结果纳入诊断标准，有25%的GeneXpert阳性儿童可以提前31 d接受抗结核药物治疗，有50%的GeneXpert阳性儿童至少可提前6 d开始接受抗结核药物治疗。

三、基因组测序与线性探针技术

全基因组测序(WGS)以及二代测序(NGS)等测序技术在快速准确鉴定菌种、检测遗传多态性和耐药基因方面具有很大的临床应用潜力[32]。儿童结核分枝杆菌感染者由于在社区与结核病患者的接触史较成人单一，利用菌株分子生物学信息反向追踪接触史、传播途径等，对处理源头病例、防止感染进一步扩散有积极意义。基于培养的结核分枝杆菌表型药敏试验较为困难，而菌株基因测序分析能检测出更多未被报道的耐药基因位点。2018年，Allam等[33]报道1例由WGS技术鉴定的南非患儿胃液、肺泡灌洗液标本中的古地分枝杆菌。Colman等[34]利用扩增子测序技术对176份痰液标本进行7种一、二线药品的耐药基因检测，与表型药敏试验的检测结果符合率达97%。WGS可直接利用痰液标本检测，免去了培养步骤，可极大地缩短临床等待时间。虽然WGS应用潜力较大，测序技术服务于临床还需要在流程标准化、数据分析和注释上达成更多共识。

线性探针技术(LPAs)是利用反向杂交的原理，将特定的寡核苷酸固定在膜条上的已知位置，与生物素标记的PCR产物杂交，形成的杂交体用比色方法检测。这种方法不仅可检测异烟肼、利福平耐药基因，还可测定氟喹诺酮类、注射类二线药品的耐药性。LPAs可直接用标本进行检测，但使用培养物可增加其检测敏感度。虽然LPAs检测利福平耐药基因的准确性很高，但其会遗漏10%～15%的异烟肼耐药阳性结果，若LPAs上显示对利福平耐药而对异烟肼则显示敏感，则应进行异烟肼药敏试验[35]。LPAs被WHO推荐用于痰涂片阳性标本和分枝杆菌培养物中的利福平和异烟肼耐药性及广泛耐药结核病(XDR-TB)的检测[36]。GenoType MTBDRplus、GenoType MTBDRsl则是基于此类原理的检测结核耐药位点的商业化分子检测平台，可检测利福平和异烟肼的耐药性，并增加了gyrB、eis等新的检测位点，使其能够检测氟喹诺酮类、二线注射类药品的耐药性。Gao等[37]的研究报道显示，GenoType MTBDRsl检测氟喹诺酮类和二线注射类药品的耐药性的敏感度分别为80.5%、80.7%。

四、其他分子生物学技术

环介导等温扩增技术(LAMP)针对gyrB基因和IS6110插入序列，使用DNA聚合酶自旋环链置换介导的DNA富集进行检测，该平台设备较简单，适用于基层医疗单位。LAMP在成人痰标本中，检测的敏感度为72.6%，接近GeneXpert的水平[38]，但此项技术在儿童中的应用还有待进一步研究。

微阵列基因芯片技术是通过设计PCR扩增引物与寡核苷酸探针并在芯片上固定，继而与靶DNA片段杂交，利用芯片扫描仪对杂交后的荧光信号进行扫描，继而读取出生物信息，多用于分枝杆菌菌种鉴定以及耐药结核分枝杆菌的检测。其鉴定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌(NTM)的准确率分别达到92.31%、96.34%，并且具有简便快速的优点[39]。何珍和王璞[40]在对648例成人肺结核的研究中发现，使用痰液、肺泡灌洗液等标本，芯片法检测的敏感度达86.9%，高于培养(76.6%)；但在儿童结核病的研究中，虽然基因芯片技术敏感度仍高于培养和涂片染色，但也仅有24.3%，可能与儿童结核病本身少菌的特点和标本采集有关[6]。目前常用的微阵列平台是Affymetrix®GeneChip®系列平台，其检测出利福平耐药结核病、异烟肼耐药结核病、耐多药结核病(MDR-TB)的敏感度分别为89%、79%、79%[41]。

MeltPro®TB/STR则是结合结核分枝杆菌鉴定、结核分枝杆菌耐药检测、分子分型的一体化检测平台，其基于探针-靶杂交体的热变性产生的解链温度差异，对突变体和野生型DNA熔解温度(Tm值)差异进行分析，其中结核耐药检测试剂已获国家食品药品监督管理局认证批准，用于氟喹诺酮类药物、链霉素、乙胺丁醇的耐药检测，其一线药物检测的敏感度为87%～89%[41]。

还有一些其他辅助诊断结核病的分子生物学方法，如检测感染者外周血和体液中的miRNAs和转录RNA等。2014年，在一项纳入非洲2000余例结核病患儿的研究中，使用了51种不同RNA组成的表达谱诊断模型，在培养阳性、高度可疑而培养阴性的患儿中，敏感度均达到60%以上，高于GeneXpert检测[42]。2017年，Pan等[43]评估了miR-29a对小儿结核性脑膜炎诊断的敏感度，当标本为外周血单核细胞，敏感度、特异度和曲线下面积(AUC)分别为67.20%、88.50%和0.852；若标本为脑脊液，敏感度、特异度和AUC分别为81.10%、90.00%和0.890，两种标本联合检测则可分别提高到84.40%、95.38%和0.934[43]。

免疫学方法

一、结核菌素皮肤试验(TST)

TST试验是检测机体对结核免疫反应的经典方法，虽在BCG接种较为普及或NTM感染率较高的地区，该试验有较高的假阳性率，但因其价格便宜，容易操作，故TST对儿童结核病仍有重要的辅助诊断价值。年龄、BCG接种情况、与活动性结核病患者的密切接触史是目前研究较多的与TST试验阳性率相关的独立因素，但祁雪等[44]的研究表明，TST检测的阳性率只与活动性结核病患者接触程度有关，而与年龄、BCG接种情况无关。WHO仍推荐中、低收入国家使用TST进行结核病患儿的诊断[45]，这也适合我国国情，故TST仍是我国诊断结核分枝杆菌感染的主流免疫学方法。2017年的卫生行业新标准中，详细规定了TST在不同疫苗接种、活动接触史、免疫功能情况下的阳性判断标准[2]。

二、γ干扰素释放试验(IGRA)

IGRA包括结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)和QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)，原理是利用6 kD 早期分泌靶向抗原(ESAT-6)及10 kD培养滤液蛋白(CFP-10)刺激外周血中特异性T淋巴细胞释放IFN-γ，然后定量检测释放的IFN-γ或产生IFN-γ的T淋巴细胞数。与TST相同，IGRA无法区分结核分枝杆菌感染和结核病，阴性结果不能排除疑似结核感染或疾病的可能性[4]。与培养结果相比，IGRA在<2岁、2～岁和5～16岁儿童的敏感度分别为93.9%、100.0%和94.4%，高于成人(81.0%)，且不受病变部位的影响[7]。Pang等[46]的研究显示，对疑似结核性胸膜炎的患者，测定胸腔积液的IGRA较血液敏感度更高。在另一些研究中，IRGA显示出潜在的其他检验功能，如Andrews等[47]报道，若结核分枝杆菌感染后无症状婴儿IFN-γ水平从阴性转换到很高水平(>4倍)，其结核病风险是未升高者的40倍，高IGRA值可能是婴儿亚临床感染的标志。建议临床医生注意随访、观察儿童患者IGRA水平的动态变化，更好地判断儿童感染状态。Lombardi等[48]和Petrucci等[49]的研究结果提示, 对5岁以下(尤其2岁以下)儿童，可优先采用IGRA，并结合暴露史、BCG接种史等进行感染状态诊断。

目前，已有学者研究第二代T-SPOT.TB试剂，因加入更多种类的抗原，使得第二代试剂敏感度较第一代有所提高。如Whitworth等[50]以ESAT-6、CFP-10、结核特异性抗原Rv3615、Rv3879c为IGRA抗原研制的第二代T-SPOT.TB试剂，该试剂在成年培阳结核病患者中的敏感度达94%；若加入疑似结核病患者，则敏感度为89.2%，高于现有的T-SPOT.TB试剂检测的敏感度，但其特异度略低于第一代T-SPOT.TB。此外，目前已获美国食品药品监督管理局(FDA)批准的第二代QFT-GIT 试剂QuantiFERON-TB Gold Plus，是在第一代基础上增加了测定CD8+T淋巴细胞释放的IFN-γ的试验管，在儿童中的研究结果显示，虽然其对肺结核检测的敏感度达84.2%，但对肺外结核的敏感度仅为14.3%[51]。

三、抗原检测技术与T细胞标志物

针对儿童结核分枝杆菌感染标本中含菌量低、肺外结核较多的情况，并克服宿主预存抗体掩盖细菌抗原以及NTM同源抗原干扰等缺点，Liu等[52]利用抗体偶联的多孔盘状纳米颗粒(NanoDisks)与感染者血清中的CFP-10和ESAT-6蛋白结合，再通过基质辅助-激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)技术对其进行定量检测。结果显示该技术检测培养阳性的结核病患者敏感度达91.6%，培养阴性的少菌样本敏感度也达到85.3%。诊断肺结核的敏感度为88%，肺外结核为90%。Jørstad等[53]利用免疫组化方法，对132份肺外结核标本中的分泌蛋白MPT64抗原进行检测，其中41例儿童患者标本诊断的敏感度达100%。Gautam 等[54]采集280例肺内外结核病患儿的尿液标本，检测其中的脂阿拉伯糖原抗原，诊断敏感度为73.2%，仍高于痰、胃液和穿刺活检标本的GeneXpert和培养。抗原检测方法具有敏感度高的优势，尤其是在肺外结核、含菌量少的标本中也有较好的效果，在未来儿童结核病实验室诊断中具有较好的应用潜力。

此外，Tebruegge等[55]的研究发现，结核分枝杆菌特异性CD4+T淋巴细胞的数量和功能特征，在结核分枝杆菌感染和未感染的儿童之间、潜伏和活动性感染儿童之间差异有统计学意义，活动性感染患儿分枝杆菌特异性单阳性(TNF-α+)和双阳性(IFN-γ+/TNF-α+)CD4+T淋巴细胞的比例明显高于潜伏感染和未感染者。此外，表达IL-17的CD4+T淋巴细胞在活动性感染患儿中也高于其他两组[55]，为区分儿童结核感染类型提供了新的思路。大于1岁但小于5岁的幼儿在感染结核分枝杆菌后，容易在短时间内从潜伏感染发展为活动性结核病，故筛查潜伏感染者或/和难以获得病原学证据的患儿方面，免疫学方法具有较好的应用价值。

其他诊断新方法与联合应用

除上述介绍的实验诊断方法外，一些具有应用潜力的新方法目前也取得了可喜的进展。如TruTip工作站是进行核酸提取纯化的自动化平台，可从痰液中提取结核分枝杆菌DNA。该平台可以连接到封闭的扩增子系统，用于扩增和基于微阵列检测结核分枝杆菌以及许多与耐药相关的基因。该方法检测结核病患儿粪便标本的敏感度为59%，对涂阴培阳患者检测的敏感度为40%[56]。Lyu等[57]用荧光底物探针技术，先将30 pl的液滴再次分散，使每个小液滴中包含单个细菌，再对其中结核分枝杆菌分泌的BlaC(一种高度保守、特异的A类β-内酰胺酶)进行定量测定，其能够检测出低至10 CFU/ml的细菌浓度，但其在临床标本中的应用还需进一步探索。Cheng等[58]研究报告了双靶向小分子探针CDG-DNB3，该探针在BlaC活化后发出荧光，结合自动的微流体芯片已实现了BCG的快速标记和自动定量。结核分枝杆菌蛋白芯片检测方法是一种快速固相膜检测手段，利用微阵列技术将纯化阿拉伯甘露糖(LAM)、相对分子质量为16 000(rTPA16)和38 000(rTPA38)的结核分枝杆菌重组蛋白3种抗原固定于同一膜片上，与血清结合后，再以胶体金作为显色剂直接在膜上显色。当任一种抗体检测为阳性时，均可确定为结核分枝杆菌感染，在儿童患者中检测的敏感度为46.7%，特异度为90%[59]。总之，检测宿主在感染结核分枝杆菌后的基因转录、蛋白产生、标志物的变化等是诊断结核分枝杆菌感染的新策略，适用于外周血、唾液或尿液等非痰标本检测，这对于肺外结核发病较多、标本中含菌量少及咳痰困难的儿童感染者，均有重要的应用价值。

此外，不同实验诊断技术联合应用对提高儿童结核病的诊断效率有重要意义。除上述多次取样、同一方法联合不同标本类型检测外，还可采取多种检测方法，结合不同检测方法的结果对及时准确诊断出儿童结核病帮助较大，并且容易实施。Rachow等[22]的研究中，在涂片、培养、GeneXpert检测儿童痰标本的敏感度均低于60%，但3种方法联合使用检测的敏感度则提高到77.9%。Chiappini等[60]报道了胃液标本研究：当以临床诊断作参考时，PCR检测的敏感度为22.5%，高于涂片(12.7%)，低于培养(39.2%)；若同时使用涂片、培养和PCR，可以将胃液检测敏感度提高到44.1%。Wang等[5]报道联合组织活检和培养诊断儿童结核性胸膜炎的敏感度接近100%。Pan等[61]研究发现，在痰涂片阴性情况下，联合GeneXpert检测后敏感度可提高28.6%。Elzi等[62]对结核病并发HIV感染的患者进行了研究，结果显示联合TST和IGRA检测的敏感度(67%)高于单独的IGRA检测(39%)和TST试验(50%)，且不受CD4+T淋巴细胞计数影响。由此可见，在现有实验室条件情况下，增加采样次数、标本类型、检测方法的使用，再结合临床表现和接触史等暴露因素的调查，儿童结核病的诊断将更加快速准确。

小 结

实验室检查在儿童结核病诊断中具有重要作用，准确、及时地病原诊断对儿童结核病的治疗和预后均具有重要意义。笔者部分列举的新方法仅从成人结核病诊断结果中推断出儿童的适用性，故目前亟需以儿童为研究对象来评估这些新技术与方法的诊断效能。鉴于儿童结核病自身特点，与成人结核病的实验室诊断相比，儿童结核病的检测应强调重复多次取样、多种标本类型和检测方法联合运用、重视分子生物学和免疫学方法的检测结果；同时提高无创、易获取标本类型(如呼吸道拭子、尿液、粪便等)在不同检测技术与方法中的敏感度。另外，未来还需要进行更多儿童结核病诊断技术与方法的专门研究，以便实验室检测能够在儿童结核病诊治中发挥更重要的作用。