结核分枝杆菌对乙硫异烟胺/丙硫异烟胺耐药的机制及其增敏剂研究进展

宋艳华 高孟秋 李琦

耐药结核病(MDR-TB)是全球结核病控制的重大挑战。2019全球结核病播报数据显示，全球估计约有48.4万例为新发的耐利福平结核病(rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)，其中有78%为MDR-TB。 中国是MDR-TB高负担国家之一，和印度、俄罗斯3个国家占了全球1/2的MDR/RR-TB患者[1]。对一线核心抗结核杀菌药品异烟肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RFP)耐药的MDR-TB，需要二线抗结核药物治疗，WHO指南推荐4～5种抗结核药品组成MDR-TB治疗方案[2]。二线抗结核药物因为不良反应多、用药不便、疗效欠佳等局限性，往往导致不规律治疗，增加产生广泛耐药结核病(XDR-TB)的风险。研发新型有效的抗结核药物是治愈MDR-TB的关键，目前只有贝达喹啉和德拉马尼两种药品用于临床。乙硫异烟胺(ethionamide，ETH)/丙硫异烟胺(prothionamide，PTH)是在1950年发现的抗结核药物，但是因为这两种药品的有效浓度和药物不良反应(消化道反应、肝损伤等)相关，限制了应用，一直为二线抗结核药品；ETH/PTH对一线药物耐药的MTB仍可敏感，所以随着对INH、RFP耐药的MDR-TB的增多， ETH/PTH主要用于MDR-TB的治疗，目前仍是WHO相关指南推荐为RR-TB/MDR-TB治疗的药品之一[2]。近年来， ETH/PTH增敏剂的研究也取得了明显进展。笔者就两种药品的应用史、流行病学、作用机制、耐药及与INH交叉耐药机制、增敏剂研究等方面进行综述。

一、ETH/PTH简介

ETH和ETH是在20世纪50年代后期合成，都是异烟酸的衍生物。两种药品在体外和体内都表现出了抗MTB活性，作用机制和INH相似，都是抑制分枝菌酸的合成，但抗菌活性较INH活性低，ETH对MTB野生株的最低抑菌浓度(MIC)为 0.5～2 mg/L； PTH对MTB的 MIC值在0.125～1.0 mg/L[3]。PTH在小鼠体内表现出和ETH相似的抗菌活性，并且患者使用中不良反应较ETH少[4]。ETH与PTH结构和作用机制相似，可以视为同一种药物，在应用中两药可以相互代替[5-6]，我国仅生产PTH，属于二线抗结核药品，因为口服方便性及可获得性，PTH目前在我国的MDR-TB方案中常作为一个基本的组成部分[6-7]。

二、流行病学

PTH作为二线抗结核药品，在我国抗结核药物治疗中的应用远不如一线抗结核药物普遍，但是由于和INH存在部分交叉耐药性，并且随着在MDR-TB患者中的应用时间延长，PTH耐药株在我国的流行情况及耐药特征需要了解。2010年我国结核病流行病学调查显示，INH耐药率为 30.8%，PTH总耐药率为12.9%(95%CI：9.2%～17.4%)[8]；来自部分结核病防治机构的数据显示，MDR-TB(包括XDR-TB)中PTH耐药率为4.5%和6.0%[9-10]；来自一些结核病专科医院的数据显示 MDR-TB(包括XDR-TB)的PTH的耐药率为20.0%～24.8%[11-13]，其中笔者的研究(数据来自北京胸科医院)显示PTH的耐药率随着MDR-TB到XDR-TB耐药谱的增宽，PTH耐药率逐渐增高，在MDR-TB中为11.2%，pre-XDR-TB中为30.1%，XDR-TB中为70.6%[14]。而非洲的MDR-TB患者中对ETH的耐药率较高， MDR-TB 临床分离菌株中 78.6%(11/14)对ETH耐药，在泰国的MDR-TB患者中这一耐药率为15.0%[15]。对ETH耐药的菌株基本上都对INH耐药[16-17]。由此可见，在不同地区对INH耐药的菌株(尤其是MDR-TB)同时对ETH/PTH耐药的耐药率具有差异性， ETH/PTH的应用需要结合所在地区的耐药菌株流行情况制订合理的治疗方案。

三、ETH/PTH的抗结核作用机制

ETH/PTH的抗结核作用机制主要是抑制敏感细菌分枝菌酸的合成而使细胞壁破裂[6]。INH、ETH/PTH和吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)相似，需要在细菌体内激活而发挥作用。ETH/PTH由黄素腺嘌呤二核苷酸单加氧酶(EthA，又称EtaA，由Rv3854c编码)激活，形成ETH-NAD或者PTH-NAD复合物，之后和INH作用机制相似，作用于enoyl-ACP还原酶(InhA，Rv1484编码)[18]，进而降低单不饱和酰基ACP(acyl-ACP)到酰基ACP的合成，干扰脂肪酸合酶Ⅱ(FASⅡ)形成，导致分枝菌酸的生物合成的受阻，导致MTB死亡[18-19]。但是因为和INH存在部分相同作用通路，导致INH和ETH/PTH存在着部分交叉耐药。

四、对ETH/PTH耐药的机制

对ETH/PTH耐药的机制，主要包括ETH/PTH前药激活酶 EthA和EthA的转录调控因子EthR、药物的作用靶点enoyl-ACP还原酶InhA编码基因突变，及其他调节药物激活或者作用的酶类基因的改变，如ndh基因、mshA基因、nudC基因等[18]。下面对3个主要的耐药机制进行说明。

(一) ETH/PTH的作用靶点InhA的改变(inhA基因突变)

ETH/PTH的作用靶点enoyl-ACP还原酶InhA基因突变，是ETH/PTH耐药机制，也是INH和ETH/PTH交叉耐药的主要机制。

1960年有研究者从用过INH但是没有用过ETH的结核病患者的临床分离株中发现了对INH和ETH共耐药的菌株[20]； 1990年随着分枝杆菌质粒转化系统技术的发展，证实MTB的InhA改变是对INH和ETH共耐药性的共同机制。Banerjee 等[21]在1994年通过构建耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)，牛分枝杆菌(M.biovs)耐药株及敏感株的基因组DNA文库，并通过质粒转染到野生型M.smegmatis、M.biovs、MTB的方法，发现inhA基因的开放阅读框(Open reading frames，ORF)突变或者inhA过度表达足以引起M.smegmatis、M.biovs、MTB对INH和ETH 共耐药，同时通过基因测序分析等方法证实inhAORF的S94A突变是引起INH和ETH共耐药的原因。把对INH和ETH耐药的M.smegmatis中的inhAS94A突变体转染到野生型MTB中，获得的菌株对INH和ETH耐药性较野生型MTB高5倍[22]。分子化学研究显示，inhAS94A突变导致InhA共作用因子NADH的米氏常数(Km值)增加，同时减少了INH-NAD和InhA(S94A)的结合，显著减弱INH-NAD对InhA(S94A)的抑制作用[23]。另外，inhA调控序列的c-15t突变，使inhA基因的mRNA水平增加20倍，导致inhA过度表达，INH和ETH的对MTB的MIC增加了8倍[23]。

在对ETH/PTH耐药的临床分离株中，inhA基因突变是比较常见的分子机制，包括调控序列和ORF突变。在对INH和ETH/PTH耐药的菌株中分别有8%～43%和47%～65%菌株存在inhA基因突变[24]，以调控序列突变为主。最常见的突变是c-15t[11,16]，对INH和ETH/PTH共耐药的菌株中约70%有此突变，其次是g-17t[16]。单inhAc-15t 突变的MTB临床株多为对INH低度耐药(MIC<2 mg/L)[22]，少部分菌株的MIC略高(MIC在2～4 mg/L)[16]；而对ETH耐药的程度变化较大(MIC从<2.5 mg/L 到≥200 mg/L)[16]。而据报道在c-15t突变的对INH耐药的菌株中有1/2以上合并KatG和ethA、inhA编码区突变[16,22]。 对INH和ETH/PTH耐药菌株的临床检测结果中，inhA的ORF突变发生率较调控序列低，主要突变类型为S94A，其次是I21T、 I95P[22]，这些突变菌株多对INH呈低度耐药[22,25]，对ETH呈高度耐药[16]。我国Tan等[26]的研究显示，在46株对PTH耐药的菌株中，26.1%菌株存在c-15t突变，13%菌株存在S94A突变。而据报道在inhA的c-15t突变的对INH耐药的菌株中有1/2以上合并katG和ethA、inhA编码区突变[22,27]。这可能是由于对INH和ETH/PTH共耐药的菌株多为MDR-TB菌株，随着耐药种类及程度的累积增加，突变基因及位点也积累增多，对INH及ETH的表型耐药也可能是不同机制的多个基因位点联合突变的结果；而且对于没有检测出inhA基因突变的临床株，选择ETH/PTH组成方案时，也要考虑其他耐药基因突变存在可能，注意观察疗效及进行表型药敏试验随访。

另外，和临床株的耐药分子机制不同，体外含INH和ETH培养基上获得的耐药株缺乏inhA基因突变[27]。既往临床株研究多数关注的是对INH或者ETH/PTH耐药的菌株(以MDR-TB为主)中inhA的突变情况，对敏感株中inhA突变情况研究较少。最近几年来数个临床研究报道，inhAc-15t(合并或不合并其他inhAORF基因突变)突变的临床菌株中仍有一定比例(13.5%～69%)的菌株对ETH/PTH敏感[11,28-31]。所以笔者认为，inhA基因突变与 ETH/PTH表型药敏试验结果为耐药的相关性可能具有地域性，inhA突变株可能存在其他机制发挥对ETH作用，inhA突变的临床意义需要进一步研究。

(二) ETH/PTH激活酶EthA的改变(ethA 突变)

ETH/PTH需要经过细菌的EthA酶激活才能发挥生物效应。在实验室由ETH药培养基筛选出耐药株，有19.4%(7/46)菌株存在ethA基因错义或缺失突变[29]。在临床株研究中，ethA基因突变也是对ETH耐药的一种重要分子机制。据报道，在对ETH耐药的MDR-TB临床株中有54.2%～100.0%菌株存在ethA突变[15,17,32]，部分菌株合并inhA基因突变。基因ethA的突变中大约2/3的核苷酸变化是错义突变，而其余则是插入、缺失或无意义突变；这些突变位点分布在ethA的整个编码区域，没有优势突变位点[18]。我国Tan等[26]的研究中，46株对PTH临床耐药的菌株中，19株(51.4%) 有ethA突变，16 株(43.2%)有inhA调控序列突变，6 株(16.2%) 为inhAORF突变。法国一项研究显示，对ETH耐药的菌株中，62%菌株具有inhA的突变(ORF和/或调控序列)，47%的ethA存在突变[32]。不同地区菌株ethA的突变率有差异，结合体外研究数据，考虑ethA基因突变和ETH药物应用，是造成对ETH耐药的重要机制，对于ETH应用较广泛或者耐药率较高的地区，在考虑选择ETH组成方案时，有必要进行ethA基因的分子耐药检测。

(三) EthA调控因子EthR的改变(ethR基因)

EthR(Rv3855)是一种转录抑制因子，负向调控ethA的转录。ethR失活的菌株对ETH高度敏感，ethR过度表达导致MTB对ETH的耐药性增加[33]。对ETH高耐药的临床株中，4%的菌株有此突变，突变类型为A95T和F110L[32]；但是部分对ETH耐药的菌株含有ethA或inhA突变。基因ethR可能在临床菌株对ETH耐药只中扮演次要的角色。但是，以ethR为靶点抑制剂的研究是新药研究的一个方向，目的是减少EthR对EthA的负向调控作用， 促进常规剂量下ETH/PTH的杀菌作用。

五、 ETH增敏剂的研究进展

细胞壁的完整性、通透性、致病性对于分枝杆菌的生存至关重要，是一个重要的药物靶点。抗结核药品ETH/PTH、INH作用于MTB的细胞壁的脂类的合成过程，对这些已经存在抗结核药物作用机制的深入了解，进一步促进了未来药物靶点的发现及新型药物的研发。近年来基于EthA转录调控因子EthR的抑制剂(ETH增敏剂)研究取得了新的进展。

ETH作为一种前药，需要细菌的单加氧酶 EthA激活才能具有杀菌活性。EthR是转录调控因子TetR家族的一员，基因ethR与ethA排列在一个共同的基因间启动子区域的不同操作子中，负向调控ethA的转录。通过抑制EthR的功能，增强ethA的表达，促进ETH/PTH 的杀菌活性，是新药研发的一个方向。

近年来，采用基于结构或者片段的药物设计方法，通过虚拟筛选新型分子结构物，在寻找EthR 抑制剂方面进行了大量的新型分子研究，发现一些化合物(如BDM31343、BDM41906)能具有抑制EthR的作用。体外及动物体内研究显示，这些抑制物和ETH同时应用，可增强ETH对MTB敏感菌株的杀菌活性[34]；同时提高了对INH和RFP耐药的MDR-TB菌株杀菌作用，但是对ethA突变耐药菌株杀菌作用不确定。在对EthR 抑制剂进一步结构改造中发现的一种新型化合物SMARt-420，这种化合物失去了与EthR结合的能力，但是它仍然能增强ETH抗结核作用[35-36]。用SMART-420处理的牛分枝杆菌BCG转录组的分析，揭示了编码转录调节因子和氧化还原酶(分别命名为EthR2和EthA2)的两个隐性基因的强烈诱导， SMART-420的靶点是EthR2，而不是EthR[37]。SMARt-420与EthR2结合并改变其构象，从而阻断后者在EthA2启动子上游的结合。基因ethA2和ethR2是一对ethA和ethR同源基因，EthR2抑制EthA2的转录表达，而不是EthA。 EthR2和EthR分子结构相似， SMARt-420 通过抑制EthA2作用，增加对ETH有激活作用的EthR2的表达，同时绕过ethA、ethR基因突变靶点，所以SMARt-420 和ETH联合可以增加敏感株对ETH敏感性，同时提高ethA基因突变的耐药菌株对ETH的敏感性，其发挥作用的靶点仍是InhA[36]。SMARt-420作为ETH的增敏剂的出现将在绝大多数MDR-TB中提高ETH的杀菌活性，即使对ETH耐药的ethA突变菌株，也能发挥杀菌活性。但是其人体安全性及有效性数据需要进一步验证。

另外，以InhA为靶点的新型药物研究也有发现。烯酰-ACP还原酶InhA是参脂肪酸合成的酶，是抗结核药物开发的有效靶点之一。大多数对INH耐药的是katG突变，导致INH-NAD复合物形成障碍，使得INH不能被激活； ETH/PTH发挥杀菌作用也是同样需要激活，ethA等突变导致其激活受阻，进而不能和InhA结合发挥生物活性。但是设计直接抑制InhA的化合物就可以绕过katG基因和inhA基因，直接发生效应[38]。研究已经发现了一些化合物对MTB的InhA有明显的抑制作用。如二苯醚衍生物具有和InhA具有高亲和力等特点，但一些二苯醚化合物只在体外具有显著的疗效，没有体内活性。在InhA抑制剂中，4-羟基-2-吡啶酮(4-hydroxy-2-pyridones)是种具有体外及体内显著抑制InhA活性和较好药代动力学参数的新化学物[38]，具有一定的研究和应用前景。

六、总结

ETH/PTH目前仍是WHO耐多药治疗指南和我国专家共识推荐的治疗MDR-TB的药品，了解耐药特征及分子机制，将指导我们选择药物组成合适方案，同时基于ETH、PTH作用机制的新药的研发，为耐药结核病治疗及终结结核病的目标带来新的希望。