中药对结核病免疫调控机制的研究进展

夏露 卢水华 刘平

中药用于抗结核治疗已有2000余年的历史，在我国结核病的防治中曾起到过重要作用，现代随着异烟肼等一线抗结核药物问世，中药在结核病治疗中的作用逐渐被忽视。近10余年来，人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染、器官移植、免疫抑制剂应用和耐药结核病患者逐渐增多，而西药抗结核药物种类有限，新药问世数量少，现有抗结核一线药物和二线药物存在交叉耐药，且不良反应重，免疫调节作用差，使耐药结核病及免疫功能低下的结核病患者在治疗时遇到困难。中药因在增强结核病患者免疫功能、抑制耐药结核分枝杆菌生长等方面具有独特效果[1]，故在结核病治疗中的作用再次受到关注。

大量临床及药理研究表明，中药不仅对结核分枝杆菌有明显的抑制作用，而且能减轻抗结核药物的不良反应，调节机体免疫功能。国内研究者除进行中药辅助治疗结核病的临床研究外，还进行了大量中药对结核分枝杆菌的体外抑菌作用和对免疫功能影响等方面的基础研究，并发表了大量的研究成果及文献综述[2-6]。笔者主要针对中药小分子化学物质及中药提取物对结核病的免疫调控作用进行综述，探索其作用机制，为中药辅助治疗结核病提供科学依据。

一、通过诱导细胞自噬杀灭结核分枝杆菌的中药提取物

巨噬细胞自噬是清除结核分枝杆菌胞内感染的直接途径，同时也对抗炎因子分泌机制进行调控，目前运用中药单体诱导巨噬细胞自噬杀灭结核分枝杆菌的研究仍然较少，但中药小分子化合物诱导结核分枝杆菌自噬有着较大的发展前景和研究空间[7]。目前研究证实有促进自噬功能的中药成分主要如下。

1．黄芩苷：黄芩苷是黄芩属唇形科植物黄芩干燥根中提取的一种黄酮类化合物。Zhang等[8]研究表明，黄芩苷是一种很有前途的抗结核分枝杆菌药物，可以作为针对宿主导向治疗(host-directed therapy，HDT)的新型辅助药物，用于辅助治疗结核病。具体机制如下：(1)核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(uncleotide binding oligomerization domain-like receptors, NLRP3)炎症小体可导致结核分枝杆菌感染期间的炎症组织损伤，而黄芩苷可以以剂量依赖的方式降低NLRP3的含量；此外，还能降低受结核分枝杆菌感染的巨噬细胞上清液中炎性小体源性的白细胞介素1β(IL-1β)数量，Zhang等[8]研究表明，黄芩苷能抑制结核分枝杆菌诱导的NLRP3炎症小体活化和炎性小体衍生的IL-1β的产生，黄芩苷促进炎性小体与自噬体的共定位可能是自噬降解作用对减少炎症小体激活的潜在机制。(2)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路是具有酶活性的经典细胞内信号转导通路。Zhou等[9]和Heras-Sandoval等[10]的研究表明，已知PI3K/AKT/mTOR通路的抑制和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的激活均可诱导自噬激活。Zhang等[8]分析了黄芩苷对这两种信号通路的影响，结果表明，黄芩苷分别降低了Ser473和Ser2448的AKT和mTOR的水平，但未改变单核巨噬细胞白血病细胞(RAW 264.7)和RAW 264.7中的P38蛋白，以及c-Jun氨基末端激酶(JNK)或细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化，由此证明黄芩苷可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路而非MAPK通路加强自噬。除细胞自噬外，黄芩苷对核因子κB(NF-κB)活性具有明显的抑制作用，NF-κB在NLRP3炎症小体的激活及参与炎症的各种基因的转录诱导中起着重要作用。RAW 264.7和原代腹腔巨噬细胞中P65蛋白磷酸化水平的升高证明结核感染可引起NF-κB信号的激活，而黄芩苷治疗明显减少了磷酸化蛋白的产生并阻止其进入核内。基于这些结果，该研究得出结论，黄芩苷通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路、自噬诱导和抑制NF-κB等多途径，抑制NLRP3炎性小体及促炎细胞因子IL-1β产生，从而达到辅助抗结核治疗的目的。

2. 虎耳草糖苷D(saxifragifolin D，SD)：SD是一种五环三萜类化合物，最初从虎耳草的伞形雄蕊中分离得到。Zhou等[11]的研究表明，中药SD可减弱结核分枝杆菌在人髓系白血病单核细胞(THP-1)源性的巨噬细胞中的细胞内复制，促进结核分枝杆菌感染的巨噬细胞的吞噬体成熟，从而达到抗结核的作用。具体作用机制可能与磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(PAMPK)/激酶亚基Vps34复合物Ⅱ依赖性途径介导相关，AMPK磷酸化水平的增加可能激活Vps34和自噬相关蛋白beclin1，增强Vps34复合物Ⅱ的脂质激酶活性，从而促进巨噬细胞的吞噬成熟。

二、通过增强机体免疫功能达到辅助治疗结核病的中药提取物

这类中药主要通过调整被结核分枝杆菌感染机体的体液免疫、细胞免疫达到辅助治疗结核病的目的，主要包括以下几种。

1．大黄提取物：从植物大黄中提取的小分子化合物传统上可用于治疗肺结核，有一些文献报道了大黄的活性产物，主要对结核分枝杆菌有作用的成分是大黄素、醌茜素和镰刀菌酸[12-13]。然而，这些小分子物质具体如何介导这种作用的分子机制尚不清楚。Zaman[14]利用反应组数据库对3种靶分子的作用机理进行了预测，酪蛋白激酶(CSNK)网络显示，大黄素与CSNK和雌激素受体(erbB)结合，能抑制神经酰胺从内质网向高尔基体的转运，从而导致Wnt通路上调，Wnt通路可使细胞免疫功能增强，从而达到抑制结核分枝杆菌的目的。镰刀菌酸可与多巴胺β-羟化酶(DBH)结合，DBH通过快速神经刺激引起细胞免疫的普遍上调。醌茜素与胰高血糖素受体(GCGR)结合，并触发G蛋白连接的信号通路，然后G蛋白连接的通路激活腺苷酸环化酶(AC)，从而导致环磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)产生。PKA诱导了大量的细胞活动，包括离子通道开放和转录因子介导的基因诱导，从而加速免疫细胞的代谢活性，进而加强对肺结核机体的免疫功能。然而，该研究是通过分子网络研究预测所选天然药物的目标分子的抗结核机制，尚需要在体外进行试验，以获得确凿的证据。

2．异甘草素(isoliquiritigenin，ISL)：ISL是一种来自甘草的抗炎类黄酮。Wang等[15]研究认为，ISL可以抑制干酪样坏死及周围朗罕细胞肉芽肿性炎症的形成。其采用新西兰白兔模型评估ISL治疗脊柱结核的作用，通过不同浓度的ISL对感染结核分枝杆菌H37Rv的兔子进行干预，采用酶联免疫吸附试验评估血清细胞因子白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素10(IL-10)和γ干扰素(INF-γ)水平的表达，采用蛋白质印迹法评估ISL对NF-κB信号通路中核因子κB抑制蛋白激酶(IKK)α/β、磷酸化核因子κB抑制物激酶(P-IKK)α/β和P-P65磷酸化的影响。单核细胞趋化因子1(MCP-1)是单核细胞的主要趋化因子，其缺失可使单核细胞的招募延迟，高浓度ISL可抑制MCP-1的表达。NF-κB对炎症反应有效，高水平的NF-κB能够有效地杀死细菌，而较高水平的NF-κB可能导致更多未感染的巨噬细胞聚集。Wang等[15]研究证明，ISL抑制了脊柱结核家兔的NF-κB信号传导，其中细胞核因子κB抑制蛋白α的相对表达下调，而其上游调节因子IKK α/β的磷酸化升高。而NF-κB信号下调，进一步抑制了IL-4和IL-10的水平。因此，ISL可能是一种有效的抗结核药物，通过下调治疗脊柱结核的MCP-1、NF-κB、IL-4和IL-10来抑制肉芽肿的形成。

3．黄芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)：黄芪含有多糖、蛋白质、生物碱、氨基酸、黄酮类、苷类、微量元素等多种生物活性物质，其中APS的免疫活性尤为突出，它对机体的免疫系统、内分泌系统等有广泛的影响，可以增强机体的免疫功能。细胞免疫在抵抗结核分枝杆菌感染时扮演着很重要的角色，巨噬细胞和淋巴细胞共同作用可有效抵抗结核分枝杆菌感染。在抵抗结核分枝杆菌感染时，巨噬细胞的作用是杀死结核分枝杆菌或抑制结核分枝杆菌的复制，只有活化的巨噬细胞才能产生氧自由基和一些细胞因子来杀死或抑制结核分枝杆菌的生长。APS可以提高巨噬细胞上C3b和Fc受体的活性，这些受体可以调节巨噬细胞的吞噬活动，还能促进活的巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌和分泌IL-1β、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等细胞因子，对结核病亦有很好的治疗作用[16-18]。一项APS对卡介苗免疫活性的调控机制研究表明，APS既能通过促进IFN-γ的适度分泌，提高巨噬细胞等免疫细胞对卡介苗的吞噬及杀伤效力，又能抑制肉芽肿等病理反应的强度。具体机制可能为APS可预先免疫增强皮肤相关淋巴组织中朗罕细胞和巨噬细胞等抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)表面相关分子的表达，促进APC对卡介苗的吞噬、消化，增强其递呈抗原的能力，从而使大量的淋巴细胞致敏，随淋巴循环向肺部迁移、定居，并分化为长寿命的记忆细胞，在再次免疫应答中发挥重要作用[19]。

4．其他：夏枯草提取物、大蒜素等对结核分枝杆菌都具有一定的抑菌效力。夏枯草的提取物可抑制结核分枝杆菌菌株H37Rv的活性，增加结核病大鼠IFN-γ、IL-10、白细胞介素12(IL-12)等细胞因子的释放和谷胱甘肽硫转移酶(GLS)mRNA的表达[20]。大蒜素对结核分枝杆菌的85B基因有下调作用，可诱导IFN-γ的上调与TNF-α的减少，且可明显上调结核病患者CD3、CD4、CD4/CD8+T淋巴细胞水平[21]。

三、抑制或破坏结核分枝杆菌生成的中药成分

此类中药主要通过破坏结核分枝杆菌细胞壁的合成，降低结核分枝杆菌合成酶和蛋白的表达，抑制炎症因子的合成等多种途径抑制或破坏结核分枝杆菌生成，从而达到辅助治疗结核病的目的，主要药物如下。

1．猫爪草提取物：猫爪草系毛茛科植物小毛茛的干燥块根，在中医临床上用于辅助治疗肺结核、颈部淋巴结结核。何颖[22]利用比较蛋白质组学的方法，研究猫爪草提取物对结核分枝杆菌的全细胞蛋白表达的影响，发现猫爪草提取物可导致硫代硫酸硫转移酶、热休克蛋白X、琥珀酰辅酶A合成酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶等4种结核分枝杆菌基因组编码的蛋白质表达下调。具体机制如下：(1)猫爪草提取物可下调结核分枝杆菌硫代硫酸硫转移酶的表达，通过对该酶的抑制，对结核分枝杆菌的氨基酸代谢、转录水平、氰化物的解毒以及硫和铁转移等方面产生影响，从而降低其存活能力，达到杀灭细菌的目的。(2)在原核生物的蛋白质合成时，延伸因子EF-Tu和EF-Ts对蛋白链的延长起着重要作用，猫爪草提取物可控制对EF-Ts的表达，通过在RNA转录和蛋白翻译水平上对细菌蛋白合成的抑制来影响其生存能力。(3)热休克蛋白X是结核分枝杆菌中的一种16 kDa的蛋白，具有分子伴侣和转录因子特性，猫爪草提取物作用后热休克蛋白X的明显下调说明该药物通过影响结核分枝杆菌hspX蛋白的表达，影响结核分枝杆菌的转录和蛋白表达，破坏其细胞壁结构，影响细菌的正常代谢，并有利于药物的进入。(4)猫爪草提取物可导致S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表达下调，猫爪草提取物通过对该酶的抑制，可能从与甲基化相关的一系列代谢及微生物次生代谢方面来影响细菌的活力；另外，抑制该蛋白可能还可以减弱细菌的耐酸性，从而影响结核分枝杆菌潜伏感染期对周围酸性环境的耐受性。

2．虫草素：虫草素首先从冬虫夏草的培养物中分离出来，它是一种核苷类似物，在结构上类似于腺苷，可以被腺苷激酶转换成活性代谢产物。腺苷激酶是一种嘌呤补救酶，使用三磷酸腺苷(ATP)作为磷酸供体催化腺苷磷酸化为一磷酸腺苷(AMP)并释放二磷酸腺苷(ADP)，这是嘌呤补救途径中的重要步骤。Huang等[23]的研究表明，虫草素可以有效阻止结核分枝杆菌复合群(包括结核分枝杆菌和牛分枝杆菌)和非结核分枝杆菌菌株(包括鸟-胞内分枝杆菌)的生长。结核分枝杆菌对虫草素的敏感性需要活性腺苷激酶，而腺苷激酶是虫草素的潜在靶标，体外试验中分别将低、中、高浓度的虫草素与腺苷激酶混合时，发现高浓度的虫草素作为腺苷激酶的底物，可竞争性地抑制腺苷激酶对腺苷磷酸化的催化活性，因此虫草素在体外有剂量依赖性的抗结核分枝杆菌作用。此外，该研究还进一步发现共同使用虫草素和腺苷脱氨酶抑制剂(脱氧助间型霉素)可以更有效地杀死牛分枝杆菌和结核分枝杆菌，而虫草素可被腺苷脱氨酶水解成无活性代谢物，并且该途径可被脱氧助间型霉素切断。此研究证明虫草素可以通过抑制细菌腺苷激酶来杀死结核分枝杆菌，这提示了一种潜在的抗分枝杆菌机制。

3．倍半萜内酯(micheliolide，MCL)：MCL是一种从木兰科植物中分离出的天然植物萜类化合物。Zhang等[24]的研究表明，MCL可以通过以下3种途径抑制结核分枝杆菌：(1)下调IL-1β和TNF-α的分泌，抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的产生，从而降低RAW 264.7中结核分枝杆菌感染诱导的促炎细胞因子的产生。(2)NF-κB是Toll样受体(TLR)下游的关键转录因子，参与了广泛的炎症性疾病，NF-κB信号通路在NLRP3炎症小体激活中起着重要作用。NF-κB信号通路在促炎性细胞因子的转录中起着重要作用，并有助于NLRP3炎症小体的激活。MCL可抑制NF-κB的P65蛋白亚单位的磷酸化，从而抑制NF-κB向细胞核的转移，通过下调NF-κB水平，MCL能抑制结核分枝杆菌诱导的NLRP3炎症小体激活。(3)在PI3K/AKT信号通路中，MCL对AKT磷酸化有快速抑制作用，通过抑制NLRP3炎症小体的活化和影响NF-κB的活化，MCL发挥了抑制结核分枝杆菌诱导免疫应答的作用。Zhang 等[24]的研究显示，MCL通过调节PI3K/AKT/NF-κB信号通路和NLRP3炎症小体的活性，在减轻结核分枝杆菌诱导的炎症反应中起着至关重要的作用。因此，MCL可望成为辅助治疗结核病的潜在候选药物。

4．姜黄素(curcumin)：姜黄素是姜黄中主要的多酚成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用。相对分子质量为19 000的脂蛋白(P19)是结核分枝杆菌细胞壁合成的，是一种可能导致感染结核分枝杆菌的人巨噬细胞凋亡的候选毒力因子。P19可诱导Toll样受体2(TLR2)活化，上调死亡受体和配体，随后激活死亡受体信号级联，诱导巨噬细胞凋亡。Li等[25]研究了姜黄素对P19诱导人巨噬细胞凋亡的影响及其机制，结果表明姜黄素可能通过抑制TLR2介导的JNK依赖性途径和MAPK依赖的信号通路，保护巨噬细胞免受P19诱导的细胞凋亡的影响。姜黄素的保护作用可归因于其阻断P19诱导的TLR2介导的JNK激活的能力，其对噬菌体的生长具有剂量和时间依赖性，高剂量姜黄素能降低人巨噬细胞的活性，低剂量姜黄素可减弱巨噬细胞生长抑制和P19诱导的IL-6和TNF-α表达的增加，还降低了由P19诱导的JNK和P38的磷酸化。

5．赤芍(radix paeoniae rubra，RPR)提取物：RPR是一种具有抗炎、保护肝脏和保护神经作用的中药材。Wang等[26]的研究证实，RPR粗提物及其组分RPR-EA-S1可影响细胞因子和趋化因子的表达，抑制结核分枝杆菌的产生。在最初感染结核分枝杆菌时，巨噬细胞分泌多种细胞因子和趋化因子，包括IL-6、IL-8和TNF-α，以介导宿主对病原体的免疫反应，结核分枝杆菌也可激活人单核细胞和巨噬细胞诱导IL-10的产生。在卡介苗刺激的巨噬细胞中，RPR粗提取物和RPR-EA-S1能特异性地抑制IL-10的产生，并能在mRNA和蛋白质水平上增强IL-8的表达，而不影响IL-6和TNF-α的表达。具体作用机制可能是RPR-EA-S1不影响MAPK、AKT和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)等细胞蛋白激酶的磷酸化，相反抑制了核因子κB抑制蛋白α在细胞质中的降解，抑制了转录因子NF-κB1 P50向细胞核的转移。

综上，中药小分子化合物主要通过以下几种机制抑制或杀灭结核分枝杆菌：(1)通过调节细胞自噬杀灭结核分枝杆菌，如黄芩苷、SD等。(2)下调全细胞蛋白表达水平，从而破坏结核分枝杆菌的表达，如猫爪草提取物。(3)抑制合成分枝杆菌的酶的活性来杀死结核分枝杆菌，如虫草素、姜黄素等。(4)调节炎症因子的表达，抑制结核分枝杆菌的产生，如MCL、RPR等。(5)通过调节宿主免疫应答，影响结核相关细胞因子的表达水平，从而达到抑制结核分枝杆菌的目的，如大黄提取物、ISL、APS等。

除中药小分子化合物外，中药复合制剂对治疗结核病也有相关研究。Fan等[27]采用卡介苗感染小鼠模型研究了益肺通络胶囊(Yi Fei Tong Luo，YFTL)对免疫调节的影响。研究发现，与未处理的小鼠相比，YFTL处理的小鼠的卡介菌负荷明显降低，伴随着肺部炎症减轻，促炎细胞因子减少和前列腺素E2(PGE2)的增加，并且在早期感染时，YFTL处理的小鼠肺中Th1细胞明显更高。目前，中药复合制剂用于结核病的临床研究报道较多，但证据级别较低，尚需高质量的人体试验证实其有效性。

中药的多靶点作用为结核病的治疗开辟了新的方向，寻找其中的有效成分和发现药物作用的靶标能为控制和治疗结核病提供重要的线索。使用中药的主要优点是，它们是取之不尽的天然药物，因为它们提供了大量具有类药物性质和结构多样性的小分子。此外，植物源性药物可以减轻许多与合成药物有关的不良反应，且价格更便宜，并具有较高的杀菌能力。目前，中药单体用于治疗结核病的研究多为基础研究，但用于人体的试验较少，对结核病患者的益处证据并不充分，未来需要更高质量的临床试验进一步深入地研究中药对人体的免疫调节机制。