一例猪蓝耳病病毒与产硫球链菌混合感染的报道

郭雅旭

(成都农业科技职业学院, 四川成都 611130)

2017 年7 月初,四川省都江堰市某养猪合作社购买的断奶仔猪,一周后部分出现食欲减退,精神沉郁,被毛松乱,少部分病猪耳朵及腹下皮肤发绀,呼吸困难,呈腹式呼吸,并伴有咳嗽,同时部分病猪少尿,尿液颜色呈茶色。 剖检三头病死猪均看到内脏器官出现不同程度的出血;全身多处淋巴结肿胀,呈现深红色,尤其是肺门淋巴结、下颌淋巴结和腹股沟淋巴结多呈切面浸润的暗红色;肺脏间质增宽、水肿,肺脏边缘部分塌陷,其中一头猪的肺脏已呈“橡皮肺”,支气管内有大量泡沫;心包积液增多;肾脏颜色偏苍白,且被膜较紧张,不易撕去;膀胱积尿,且黏膜肿胀充血;其他脏器未见明显病变。 据悉该批仔猪及来源场母猪未免蓝耳疫苗,临床初诊为疑似高致病性猪蓝耳病(HPPRRS)。 而单纯的HPPRRSV 感染通常不引起肺脏边缘的塌陷以及尿液性状的改变,怀疑存在混合感染,遂取材做实验室诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 取病猪肺脏、淋巴结、膀胱等病变器官组织于无菌自封袋,冰袋冷藏,运输至实验室。

1.1.2 主要试剂 组织总RNA 提取试剂盒,2×Taq PCR Master Mix,购自天根生化科技有限公司;反转录试剂盒,购自TAKARA;三糖铁培养基,药敏纸片,革兰氏染液试剂盒,购自杭州微生物试剂有限公司;胰大豆蛋白胨琼脂(TSA)培养基,购自Becton,Dickinson and Company。

1.2 主要仪器

超净台,冷冻离心机,恒温培养箱,购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;PCR 仪,电泳槽,凝胶成像系统,购自Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒抗原检测 对三份病料研磨后按照试剂盒说明书分别抽提RNA 并反转录为cDNA,随后进行PCR 检测。

1.3.2 细菌学检测 将病料分别接种TSA 培养基后培养24h,挑取典型优势单菌落进行染色、镜检,随后用细菌16S 通用引物进行扩增后送测序。

2 结果

2.1 病毒抗原检测

病毒扩增结果显示,三份病料的高致病性蓝耳病毒核酸呈阳性(见图1)。

图1 病料高致病性蓝耳病毒RT-PCR 检测结果

2.2 细菌学检测

细菌镜检结果显示为革兰氏阳性、长度不一的链状球菌,与猪链球菌极为类似,难以从形态上鉴别(见图2)。 细菌16S rRNA 扩增产物测序结果显示,与球链菌属(Globicatella)的血球链菌(Globicatellasanguinis)和产硫球链菌(Globicatella sulfidifaciens)的同源性均为99%,只能鉴定到属。

图2 病料细菌分离株革兰氏染色

查阅资料后,发现产硫球链菌能发酵三糖铁并产生H2S,而血球链菌无此特性,因此补充了生化试验[1]。 结果显示,该分离株可以使三糖铁斜面培养基变黄,证明产生了H2S,因此判定该分离株系产硫球链菌(见图3)。

图3 细菌分离株三糖铁培养基生化反应

综合临床诊断和实验室诊断,判定本次发病系猪蓝耳病病毒与产硫球链菌的混合感染。

2.3 药敏试验

另外,根据文献报道,在人医上感染产硫球链菌的病例对头孢曲松钠敏感[2]。 后续又选用了同为第三代头孢的专用兽药头孢噻呋钠以及其他抗生素做药敏试验,结果显示该分离株对头孢噻呋钠极为敏感,对恩诺沙星和氟苯尼考较敏感,亦进一步佐证了上述结果(见表1)。 随后将药敏结果反馈该养猪合作社。 一周后回访,该合作社表示,积极采取措施并配合用药后,疫情已基本控制。

表1 病料细菌分离株药物敏感性试验结果

3 讨论

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRSV 引起的以妊娠母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道综合征为特征的疾病。 PRRSV 具有典型的免疫抑制和抗体依赖增强作用,能持续感染。 感染PRRSV 的公猪其精液中长期带毒,在妊娠期85 d 至90 d 经胎盘感染PRRV 的猪,出生后210 d 仍能从其血清种检测到病原。 同样地,PRRSV 弱毒疫苗一旦接种,其抗原难以消除,因此很多猪场未免疫PRRSV,其弊端在于一旦感染PRRSV,发病率和死亡率都会相对较高[3-5]。 此病例为买回一周左右的断奶仔猪,可能购前已感染病原。 此类需从外界购买断奶仔猪进行育肥的猪场,购猪前应了解该猪场的免疫背景,最好从饲养管理科学、有良好卫生防疫条件的规模猪场购买。 运输过程应注意季节和温度的影响,采取必要的保暖(降温)措施,新进的仔猪必须隔离观察至少15d 后再转进保育舍。 对于规模化猪场,要建立稳定的种猪群,不轻易引种,如必须引种,首先要搞清所引猪场的疫情和免疫背景,并进行血清学检测,阴性猪方可引入;要建立健全生物安全体系,定期对猪舍和环境进行消毒,保持猪舍、饲养管理用具及环境的清洁卫生,彻底实现全进全出,至少要做到产房和保育两个阶段的全进全出;做好其他疫病的免疫接种,特别是猪瘟、猪伪狂犬病和猪喘气病的控制,并定期对猪群中PRRSV 感染状况进行监测,以了解该病在猪场的活动状况。

1992 年,英国细菌学家Collins 等对9 株不能确定分类学地位的触酶阴性的革兰阳性球菌进行了16S rRNA 序列分析,创建了球链菌属,并将该9 株分离株命名为血球链菌(G.sanguinis)[6]。 2001 年,从小牛的关节脓液和肺脏、绵羊的肺脏以及猪的关节分离出6 株与血球链菌形态极度相似且16S rRNA 同源性在99%以上的阳性球菌,但有别于血球链菌,这六株球菌能发酵三糖铁培养基并产H2S,因此新命名为产硫球链菌(G.sulfidifaciens)[1]。 之后国外还有从母猪尿样中分出产硫球链菌的报道[7]。 在16S rRNA 序列的同源性上,已报道的血球链菌和产硫球链菌达到了99.88%,而且血球链菌的序列中包含兼并碱基,也就是说二者16S rRNA序列的同源性可能会更高,因此在现阶段用分子生物学的方法还不能将二者很好区分,鉴定到属之后便可以补充做生化试验加以鉴别[1]。

总体来说,对该属两种细菌为数不多的报道多见于人医上偶发的泌尿系统感染、脑膜脑炎以及整形外科感染等,并且都是个例,在畜牧兽医上的报道更是少之又少,属于罕见菌[2,8-10]。 对于此类罕见菌,猪场不必要进行免疫接种(而且也没有上市的疫苗),应该在饲养管理上提高重视程度,做好日常消毒工作,同时选择敏感抗生素进行治疗。