茯苓酸抑制TRIM29表达通过Wnt信号通路调控宫颈癌细胞存活和凋亡

申利， 翁丹卉

（1.华中科技大学同济医学院附属梨园医院妇产科，湖北武汉 430077；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科，湖北武汉 430030）

宫颈癌是世界范围内女性第二大常见恶性肿瘤，死亡率较高，人乳头瘤病毒（HPV）筛查是降低宫颈癌发病率的主要手段[1-2]。中药在减轻放化疗副作用和促进宫颈癌细胞凋亡等方面发挥较好的效果，对提高患者生存质量起到了很重要的作用[3]。茯苓酸（pachymic acid）是中药茯苓的主要有效成分之一[4]。研究[5-8]发现，茯苓酸对胆管癌、膀胱癌、胃癌和乳腺癌均有抑制作用，但其对宫颈癌的作用效果尚不清楚。三基序蛋白（TRIM）29是TRIM蛋白家族成员之一，与多种疾病（包括癌症、炎症性疾病、发育性染色体异常疾病等）有关[9-10]。TRIM29在宫颈癌中上调表达，与患者的不良预后相关[11]。TRIM29的表达影响宫颈癌细胞的存活[12]。因此，本研究以宫颈癌Caski细胞为研究对象，以不同浓度茯苓酸处理Caski细胞，观察茯苓酸对Caski细胞存活和凋亡的影响及TRIM29基因在该机制中的作用，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物、试剂与仪器 人宫颈癌细胞系Caski购自美国ATCC细胞库。中药茯苓购自中药材市场，由华中科技大学同济医学院附属梨园医院申利副主任医师鉴定。抗TRIM29、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（Caspase-9）、细胞周期调节蛋白Cyclin D1、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、β-连环蛋白（β-catenin）、c-Myc蛋白抗体和抗βactin抗体购自美国Abcam公司；胰蛋白酶（trypsin）、四甲基偶氮唑盐（MTT）和二甲基亚枫（dimethyl sulfoxide， DMSO）购 自 美 国 Sigma-Aldrich公司；Total RNA提取试剂盒、实时聚合酶链反应（PCR）试剂盒、反转录试剂盒购自美国Invitrogen公司；流式法细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。流式细胞仪购自美国BD公司，显微镜、全自动酶标仪及实时PCR仪购自美国Bio-Rad公司；BCA检测试剂盒购自上海碧云天生物。

1.2 细胞培养 将宫颈癌Caski细胞接种于含体积分数10%FBS、1%青霉素—链霉素的RPMI-1640培养基中，置于湿度95%、37℃、体积分数5%CO2培养箱中常规培养。细胞培养至融合度达到90%左右，收集细胞，消化传代。

1.3 药物处理 根据文献[8]的方法提取茯苓酸，检测化合物波谱，确定其为茯苓酸。使用时溶于DMSO。待细胞培养至对数生长期时，以1×104个/mL接种于96孔板，过夜贴壁，然后加入茯苓酸（0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L），培养 48 h。DMSO组仅加入DMSO作为空白对照，正常对照（NC）组加入RPMI-1640培养基。

1.4 细胞转染 待Caski细胞培养至对数生长期，用培养液稀释为1×106个/mL，以每孔2×104个细胞接种于6孔板中，培养至细胞融合为一层时进行转染。转染分组：TRIM29沉默组（转染si-con和si-TRIM29）；TRIM29过表达组（转染pcDNA和pcDNA-TRIM29）；茯苓酸+pcDNA组和茯苓酸+pcDNA-TRIM29组分别是转染后加入20.0μmol/L茯苓酸处理48 h。先用无血清Opti-MEM培养液稀释脂质体Lipofectamine 2000和各组载体，之后取等体积脂质体和载体混合，室温孵育20 min，加入到培养好的细胞中，培养6 h，换成RPMI-1640培养基，转染48 h，收集细胞，进行后续实验。

1.5 指标检测与方法

1.5.1 采用MTT法观察细胞生存能力 收集培养至对数生长期的Caski细胞，接种于96孔板中（每孔1×104个细胞）。过夜培养后，分别加入终浓度为0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L的茯苓酸。再继续培养48 h，加入20μL MTT（5 g/L）。继续培养4 h，弃培养液，每孔加入150μL DMSO溶解甲瓒结晶，室温振荡5 min。酶标仪测定490 nm处的吸光度（D）值，按照公式计算生存率。公式：生存率（%）=实验组D均值/正常对照组D均值×100%。

1.5.2 采用流式细胞术观察细胞凋亡情况 各组Caski细胞经茯苓酸处理后，以每孔2×104个细胞接种于6孔板中，培养72 h；弃去培养液，胰酶消化，收集细胞，加入200μL binding buffer重悬细胞；再加入5μL Annexin V-FITC和5μL碘化丙啶（PI）混匀，室温避光20 min，用流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.5.3 采用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测Caski细胞TRIM29基因表达 收集茯苓酸处理或转染48 h的各组Caski细胞，按照Total RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，-80℃保存。然后按照反转录试剂盒说明书合成cDNA，反应程序为42℃ 30 min、70℃ 10 min。4℃放置10 min。以合成的cDNA为模板，按照实时PCR说明书进行反应，反应条件：95℃4 min，95℃40 s，58℃45 s，72℃30 s，40个循环，72℃10 min。TRIM29上游引物为5'-TGCGAGCTGCATCTCAAG C-3'，下游引物为5'-GGTGCTATGATTCTTGTGC TCC-3'。运用Bio-Rad PCR检测系统进行数据分析。

1.5.4 采用蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测Caski细胞 TRIM29、Caspase-9、Cyclin D1、GSK-3β、β-catenin、c-Myc蛋白的表达 收集转染后经茯苓酸处理并培养48 h的各组Caski细胞，加入RIPA裂解液，重悬裂解细胞20 min，冰浴超声破碎，收集蛋白，BCA试剂盒测定总蛋白浓度。进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后转膜，室温封闭2 h；加入稀释的一抗（抗TRIM29 1∶1000、抗Caspase-91∶2000、抗Cyclin D1 1∶800、抗GSK-3β 1∶1 000、抗β-catenin 1∶1 000、抗c-Myc 1∶500和抗β-actin 1∶1 000），4℃孵育过夜，PBST洗膜3次；加入稀释的二抗，室温孵育1 h，显色，曝光，显影，定影，拍照，扫描。结果以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值（p）表示，β-actin为内参照。

1.6 统计方法 采用SPSS21.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(-x±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度茯苓酸对宫颈癌Caski细胞存活和凋亡的影响 以不同浓度（0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L）茯苓酸处理Caski细胞。MTT实验结果显示：与DMSO组比较，2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L茯苓酸均可显著降低宫颈癌Caski细胞存活率（P＜0.05），且组间下降差异显著（P＜0.05）。随着茯苓酸浓度的增加，细胞存活率呈递减趋势，具有显著的剂量依赖性，见图1-A。流式细胞术和Western Blot结果显示：与DMSO组比较，随着茯苓酸浓度的增加，细胞凋亡率呈显著上升趋势（P＜0.05），凋亡蛋白Caspase-9表达量呈显著上升趋势（P＜0.05），周期蛋白Cyclin D1表达量呈显著下降趋势（P＜0.05），见图1-B、-C、-D、-E。说明茯苓酸能够抑制Caski细胞增殖，促进细胞凋亡，升高凋亡蛋白Caspase-9表达，抑制周期蛋白Cyclin D1表达。

2.2 不同浓度茯苓酸对宫颈癌Caski细胞TRIM29表达的影响 RT-qPCR和Western Blot实验结果显示：与DMSO组比较，茯苓酸 2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L组Caski细胞TRIM29 mRNA和蛋白表达量呈依次递减趋势，且组间下降差异显著（P＜0.05），具有剂量依赖性，见图2。说明茯苓酸能够抑制Caski细胞中TRIM29 mRNA和蛋白的表达。

根据以上实验结果，选取处理时间48 h，对Caski细胞抑制效果最好的茯苓酸浓度（20.0μmol/L）用作后续实验。

2.3 沉默TRIM29表达对宫颈癌Caski细胞存活和凋亡的影响 Western Blot、MTT和流式细胞术结果显示：与si-con组比较，si-TRIM29组的TRIM29蛋白表达量显著下降（P＜0.05），凋亡相关蛋白Caspase-9表达量显著增加（P＜0.05），周期蛋白Cyclin D1表达量显著下降（P＜0.05），细胞存活率显著下降（P＜0.05），细胞凋亡率显著上升（P＜0.05），见图3。说明沉默TRIM29可促进凋亡蛋白Caspase-9表达，抑制Cyclin D1表达，抑制细胞存活，促进细胞凋亡。

2.4 过表达TRIM29部分逆转茯苓酸对宫颈癌Caski细胞存活和凋亡的作用 Western Blot、MTT和流式细胞术结果显示：与DMSO组比较，茯苓酸组TRIM29蛋白表达量显著下降（P＜0.05），凋亡相关蛋白Caspase-9表达量显著增加（P＜0.05），周期蛋白Cyclin D1表达量显著下降（P＜0.05），细胞存活率显著下降（P＜0.05），细胞凋亡率显著上升（P＜0.05）；与茯苓酸+pcDNA组比较，茯苓酸+pcDNA-TRIM29组的TRIM29蛋白表达量显著上升（P＜0.05），凋亡相关蛋白Caspase-9表达量显著下降（P＜0.05），周期蛋白Cyclin D1表达量显著上升（P＜0.05），细胞存活率显著上升（P＜0.05），细胞凋亡率显著下降（P＜0.05），见图4。说明过表达TRIM29可部分逆转茯苓酸对宫颈癌Caski细胞存活和凋亡的作用。

图1 不同浓度茯苓酸对Caski细胞存活、凋亡及凋亡相关蛋白、增殖相关蛋白表达的影响Figure 1 Effects of pachymic acid at different concentrations on cell survival，apoptosis，proliferation-related proteins and apoptosis-related proteins in Caskicells

图2 不同浓度的茯苓酸对Caski细胞TRIM29 mRNA和蛋白表达的影响Figure 2 Effects of pachymic acid（PA）at different concentrations on the mRNA and protein expression levels of TRIM29 in Caskicells

图3 降低TRIM29表达对Caski细胞存活、凋亡的影响Figure 3 Effects of down-regulation of TRIM29 on cell viability and apoptosis of Caskicells

2.5 过表达TRIM29对茯苓酸处理的宫颈癌Caski细胞Wnt信号通路的影响 Western Blot结果显示：与DMSO组比较，茯苓酸组β-catenin蛋白表达量显著上升（P ＜0.05），GSK-3β和c-Myc蛋白表达量显著下降（P＜0.05）；与茯苓酸+pcDNA组比较，茯苓酸+pcDNA-TRIM29组β-catenin蛋白表达量显著下降（P ＜0.05），GSK-3β和c-Myc蛋白表达量显著上升（P＜0.05），见图5。说明茯苓酸能够促进Caski细胞Wnt信号通路中β-catenin蛋白表达，抑制GSK-3β和c-Myc蛋白表达，下调Wnt通路活性，过表达TRIM29逆转了茯苓酸对Wnt通路的抑制作用。

3 讨论

研究[13]发现，茯苓具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等功效，茯苓酸是茯苓的主要有效成分之一。Sun等[14]研究发现，茯苓酸可显著抑制胃癌细胞SGC-7901增殖，并以浓度依赖的方式诱导G0/G1细胞周期停滞。Wen等[15]研究表明，茯苓酸可显著降低骨肉瘤细胞增殖，且呈浓度和时间依赖性，并以剂量依赖方式通过人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因/蛋白激酶B（PTEN/AKT）信号和Caspase 3/7活性介导细胞凋亡。本研究结果显示，茯苓酸能够抑制Caski细胞的增殖，促进Caski细胞凋亡，促进凋亡蛋白Caspase-9表达，抑制周期蛋白Cyclin D1表达，表明茯苓酸对宫颈癌有抑制作用。

TRIM29可通过抑制p53作用促进细胞增殖[16]。Qiu等[17]研究发现，TRIM29以癌基因形式在胃癌组织中大多呈高表达，miR-185可靶向抑制TRIM29和Wnt/β-catenin信号活性，抑制癌细胞。Xu等[11]发现，TRIM29在宫颈癌组织（4例）表达上调，与患者早期存活率有关。Zhang等[18]在用微卫星标记研究121例宫颈癌等位基因缺失时发现，TRIM29在宫颈癌组织和6个宫颈癌细胞系中都有表达。本研究结果显示，茯苓酸能够抑制Caski细胞中TRIM29 mRNA和蛋白表达，沉默TRIM29可促进Caspase-9表达，抑制Cyclin D1表达，抑制癌细胞存活，促进癌细胞凋亡，表明茯苓酸可通过抑制TRIM29表达诱导细胞凋亡，进而抑制宫颈癌。

图4 过表达TRIM29部分逆转茯苓酸对Caski细胞的抑制作用Figure 4 Overexpression of TRIM29 partially reversed the inhibitory effect of pachymic acid on cervical cancer Caskicells

图5 茯苓酸对TRIM29过表达Caski细胞Wnt信号通路蛋白β-catenin、GSK-3β、c-Myc表达的影响（A、B）Figure 5 Effects of pachymic acid on the expression of Wnt signaling pathway proteins β-catenin，GSK-3β，c-Myc in Caskicells with TRIM29 overexpression（A，B）

Wnt通路与肿瘤的发生有关，其异常激活可导致细胞异常增殖和分化，Wnt/β-catenin通路是Wnt通路的经典模式，其核心因子β-catenin在肿瘤细胞质和细胞核中表达上调，在肿瘤细胞膜中经常不表达或缺失。β-catenin的异位表达可激活Wnt通路，下游靶基因c-Myc的大量表达表明Wnt通路被激活[19]。Yang等[20]总结发现，β-catenin是宫颈癌治疗的重要靶点，也是预测宫颈癌放化疗耐受性的标志物。本研究结果显示，茯苓酸能够促进宫颈癌Caski细胞Wnt信号通路中GSK-3β蛋白表达，抑制β-catenin和c-Myc蛋白表达，下调Wnt通路活性，过表达TRIM29逆转了茯苓酸对Wnt通路的抑制作用。表明茯苓酸通过靶向TRIM29抑制Caski细胞中Wnt通路活性，抑制Caski细胞活性。

综上所述，本研究首次阐述了在宫颈癌Caski细胞中，茯苓酸靶向TRIM29基因可抑制Wnt通路活性，促进凋亡蛋白表达，从而抑制Caski细胞增殖，促进Caski细胞凋亡，达到抑制宫颈癌的作用。认为茯苓酸对人宫颈癌具有潜在的治疗作用。不足之处在于，本研究观察了茯苓酸对宫颈癌细胞的作用，但尚未进行整体动物水平的研究。下一步本研究将进行茯苓酸抑制宫颈癌的动物药理实验，以进一步明确其在宫颈癌治疗中的应用价值。