喉鳞状细胞癌患者血清中miRNAs表达谱分析

徐志远,秦 永

(1.莒南县人民医院 青岛大学医疗集团莒南医院耳鼻喉科，山东 莒南 276600；2.北京大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科,北京 100034)

尽管目前临床手术以及放化疗技术取得了巨大的进步，但全球每年仍有超过8万喉癌患者死亡[1]。喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤，其中以喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)最常见，约占90%，常见于男性[2]。喉癌诊断时往往已是晚期，患者的5年生存率低于50%[3]。喉癌的早期诊断标志物对其早期诊断和早期治疗十分重要。微RNA(microRNA，miRNA)指长度18～25个核苷酸的内源性微小非编码单链RNA，miRNA通过影响靶向信使RNA的3′非翻译区结合蛋白参与调节转录后基因表达，人体30%以上信使RNA受到miRNA的控制调节[4]。大量数据表明，miRNA在人类多种癌症中高表达，并在人类肿瘤的发生、发展和转移中起关键作用[5-9]。近年来，miRNA在LSCC靶向治疗、诊断及转移、预后等方面的研究成为喉癌的研究热点。本研究通过检测术前LSCC患者血清miRNA表达水平，并与健康者对比，以探究血清miRNA作为诊断LSCC的潜在生物标志物的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2016年1月至2019年1月莒南县人民医院耳鼻喉科收治的82例LSCC患者作为研究组，同期50名健康者作为对照组。纳入标准：①经病理活组织检查确诊为LSCC；②年龄18～80岁；③接受手术治疗；④初次诊断为LSCC的患者。排除标准：①术前接受放化疗的患者；②伴有传染性疾病(如结核)、慢性疾病(如糖尿病)以及口腔疾病(如口腔溃疡)的患者；③患有精神疾病的患者；④沟通有障碍、非自愿参与本研究的患者。本研究获得莒南县人民医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2方法 收集所有研究对象的基本资料，包括性别、年龄、吸烟史、饮酒史。收集LSCC患者的临床资料，包括肿瘤临床分期(国际抗癌联盟喉癌TNM分期)和肿瘤分化程度。于研究组治疗前采集所有研究对象同期空腹静脉血4 mL，所有血液标本经离心后，取上层血清，置于-80 ℃条件下储存备用。

1.2.1LSCC相关miRNA标志物的筛选 选取研究组和对照组各8例，采用miRNA提取试剂盒(德国Qiagen公司，批号：217184)抽提血液miRNA，随后采用带有茎环的特异引物反转录试剂盒进行反转录(德国Qiagen公司，批号：218161)，最后进行miRNA表达谱芯片检测。按照说明书进行操作，通过分析比较16例样本的血清miRNA表达情况来筛选LSCC血清miRNA标志物。

1.2.2血清miRNA标志物的表达 选择研究组和对照组平均Ct值差异有统计学意义的miRNA作为诊断LSCC的miRNA标志物。提取血清miRNA进行逆转录，使用聚合酶链反应定量检测试剂盒(德国Qiagen公司，批号：218073)检测相应血清miRNA的表达量。采用RNA U6作为内参，每个miRNA采用 3个复孔取平均值，反应体系按照说明书配置进行聚合酶链反应扩增，具体过程为：在95 ℃条件下预变性1 min→在95 ℃条件下变性15 s→在60 ℃条件下退火30 s→在72 ℃条件下延伸1 min，循环进行40次，根据与内参表达量的差值计算每种miRNA的相对表达量。

2 结 果

2.1两组一般资料比较 两组性别、年龄、饮酒史和吸烟史比例比较差异无统计学意义(P>0.5)，见表1。研究组T1～2期24例、T3～4期58例，N0期63例、非N0期19例，所有患者均无远处转移；临床分期：1～2期21例，3～4期61例；分化程度：高分化8例，中分化68例，低分化6例。

表1 两组受试者一般资料比较 [例(%)]

对照组：健康人群；研究组：喉鳞状细胞癌

2.2两组血清miRNA标志物表达的差异 研究组血清miR-31、miR-141、miR-149a、miR-182、miR-485-3p、miR-122、miR-33、miR-205的相对表达量较对照组高(P<0.01)，而miR-133a、miR-223和miR-145的相对表达量较对照组低(P<0.01)，见表2。

2.3血清miRNA标志物的诊断价值 依次分析筛选出的具有统计学意义的血清miRNAs对LSCC的辨别能力，其中miR-31的AUC值为0.99(95%CI0.99～1.00)(P<0.05)；miR-33的AUC值为0.98(95%CI0.95～1.00)(P<0.05)；miR-205的AUC值为0.97(95%CI0.95～1.00)(P<0.05)，具有较高的LSCC诊断价值，见表3和图1A、B、C。

组别例数miR-31miR-141miR-149amiR-182miR-485-3pmiR-122对照组501.46±0.331.52±0.292.42±0.561.72±0.412.72±0.612.94±0.58研究组826.94±0.365.82±0.333.38±0.614.94±0.487.88±0.659.94±0.61t值87.51275.9549.04339.45145.27265.144P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001组别例数miR-33miR-205miR-133amiR-223miR-145对照组502.76±0.621.44±0.224.08±0.432.05±0.232.94±0.21研究组8220.62±0.785.96±0.251.16±0.350.77±0.190.62±0.17t值137.510105.34242.58834.63157.234P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

对照组：健康人群；研究组：喉鳞状细胞癌患者

表3 血清miRNA标志物诊断价值

miRNA：微RNA；AUC：曲线下面积

2.4血清miRNA标志物与临床资料的相关性分析 以miR-31、miR-33、miR-205作为因变量，LSCC患者的各项临床资料[性别(以女性作为参照)、年龄(以≤65岁作为参照)、吸烟(以不吸烟作为参照)、饮酒(以不饮酒作为参照)、T分期(以T1～2作为参照)、临床分期(以Ⅰ～Ⅱ期作为参照)、肿瘤分化程度(以低分化作为参照)]作为自变量的相关分析显示，血清miR-31、miR-33、miR-205水平与患者基本临床资料均无相关性(P>0.05)，见表4。

miRNA：微RNA；LSCC：喉鳞状细胞癌

表4 血清miRNA标志物与临床资料的相关性分析

3 讨 论

LSCC是常见的头颈部恶性肿瘤，临床诊断时常已是晚期，寻找快速、无创、有效的早期LSCC生物标志物对LSCC的早期诊断至关重要。多项研究表明，miRNA在肿瘤组织和正常组织的表达水平比较差异有统计学意义，故可将miRNA作为诊断肿瘤的有效生物标志物，但获取肿瘤组织标本的过程往往是有创操作[10-14]。空腹静脉血是临床检查常见的生物学标本，具有创伤小、易于操作的特点。本研究通过比较LSCC患者以及健康对照组血清标本miRNA的表达情况，旨在筛选能有效辨别LSCC的潜在生物标志物。

miR-23在LSCC患者肿瘤组织的表达水平显著升高，且与LSCC患者的临床分期及5年生存率存在显著相关性[15]。研究发现，肿瘤组织miRNA分子可作为喉癌诊断及其预后判断的有效生物学指标，其中部分miRNA(如miR-221和miR-378)可作为评估喉癌患者疗效及预后的有效生物标志物[16-18]。对喉癌患者肿瘤组织样本中miRNA表达情况的研究发现，miR-885-5p是区别喉癌组织与正常黏膜组织的最佳生物学指标[19]。但目前针对血清miRNA表达水平对喉癌诊断价值的系统报道较少。

本研究首先通过miRNA表达谱芯片检测筛选出LSCC患者异常表达的miRNA分子，其中miR-31、miR-141、miR-149a、miR-182、miR-485-3p、miR-122、miR-33、miR-205显著升高；miR-133a、miR-223、miR-145显著降低。目前miR-31与LSCC关系的报道较少见，但有报道称，食管癌患者血清miR-31过表达与疾病复发、肿瘤特异性生存时间显著相关[20]。研究证实，癌细胞中miR-182升高，且miR-182升高与p53过表达密切相关，可促进头颈部鳞状细胞癌患者体内癌细胞的增殖和转移[21]。本研究中，LSCC患者血清miR-145表达水平显著降低，可作为食管癌患者的肿瘤抑制因子，此外，血清miR-133a和miR-223亦显著降低，与Gao等[22]的研究结论相似。有研究表明，miR-145、miR-133a、miR-223可直接调控致癌基因FSCN1的表达，参与食管鳞癌的发生和发展[23]。但有研究表明，胰腺肿瘤患者血清miR-223表达水平显著升高[24]，本研究则得出不一致的结论。以上研究的差异性可能与不同研究的标本选择、病例来源以及生存环境等有关。吸烟、饮酒以及人乳头瘤病毒感染是喉癌的重要致病因素[25]。吸烟、饮酒等生活习惯可引起miRNA表达改变，导致不同研究结果的差异。本研究未探究miRNA表达水平与患者生存预后的关系，仍需进行大样本队列研究来进一步探究可用于评价LSCC患者疗效及其预后的有效生物标志物。

综上所述，血清miRNA的稳定性较高，便于取样，易于检测，具有很高的临床应用价值；LSCC患者和健康者的血清miR-31、miR-33、miR-205存在明显差异，可能成为诊断LSCC的有效生物标志物。