130例梅毒筛查检测弱反应性结果分析

王欣俞，丁晓娜，赵晋文，崔 凯，潘 杰，王鑫琪，张延海，高德禄，郭奕阳，马海娜※

(1.河北燕达医院检验科，河北 廊坊 065201； 2.河北燕达医学研究院，河北 廊坊 065201；3.河北医科大学第四医院检验科，石家庄 050011)

梅毒是由梅毒螺旋体(treponema pallidum，TP)感染引起的一种慢性、系统性性传播疾病[1]。其可侵犯全身机体，导致急性皮肤感染、生殖器溃疡、脊髓病变、主动脉瓣关闭不全、主动脉瘤、麻痹性痴呆、视神经萎缩，严重情况下可导致患者死亡[2-3]。梅毒的传染途径主要为性接触，其可呈现进展型发病趋势，但临床症状和体征不具有特异性，故加强早期诊断意义重大[4]。TP侵袭力极强，可破坏患者表皮或黏膜屏障的完整性，使人类免疫缺陷病毒更易进入和排出宿主，导致梅毒患者感染或传播人类免疫缺陷病毒的风险增加4～5倍，从而促进人类免疫缺陷病毒的感染和传播[5]。由于TP具有无法在体外连续培养、基因操作困难、细胞膜易碎难以提取等缺点[6]，也无有效疫苗，故早期筛查与诊断梅毒具有重要价值[7]。目前，梅毒的诊断主要依据临床表现和实验室检查，实验室检查包括梅毒的暗视野显微镜检查、梅毒血清学检测、梅毒聚合酶链反应检测等。由于梅毒暗视野显微镜检查和梅毒聚合酶链反应检测受实验条件、梅毒病程影响，检出率不高，所以临床最常用的检测方法为梅毒血清学检测[8]。本研究通过分析130例梅毒筛查弱反应性结果，旨在探讨实验室检测方法在临床结果判读诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性纳入2018年1月至2019年6月在河北燕达医院体检中心、门诊和住院部进行全自动化学发光微粒子免疫分析法(chemiluminescence microparticle immunoassays，CMIA)梅毒实验室血清筛查的38 331例患者，选取S/CO值1～9弱反应性且快速血浆反应素环状卡片试验检测均为阴性的130例患者作为研究对象，其中男62例，女68例，年龄28～89岁，平均(57±13)岁，年龄集中在45～60岁。人群分布：老年人31例，男15例，女16例；神经系统相关疾病24例，男11例，女13例；心血管相关疾病23例，男15例，女8例；肿瘤相关性疾病19例，男10例，女9例；孕妇14例；感染性相关疾病8例，男3例，女5例；风湿免疫相关性疾病7例，男5例，女2例；体检人群4例，男3例，女1例。

1.2试剂与仪器 CMIA检测试剂(批号：9331LI00)由美国雅培公司生产，其配套仪器为全自动微粒子化学发光免疫分析仪(美国雅培公司，型号：Architect i2000SR)；化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)检测试剂(批号：128058)由德国西门子公司生产，其配套仪器为全自动化学发光免疫分析仪(德国西门子公司，型号：ADVIA Centaur XP)；梅毒螺旋体颗粒凝集试验(treponema pallidumm particle agglutination，TPPA)检测试剂购自日本富士瑞必欧株式会社(批号：WN81019)；梅毒螺旋体免疫印迹试验(treponema pallidum-western blot，TP-WB)检测试剂盒购自德国欧蒙公司(批号：D180619AG)。梅毒实验室检测按标准化操作文件执行。检测样本时，同测室内质控品及阴、阳性对照，以保证监控检测质量。

1.3方法 采用CMIA初筛检测TP特异性抗体，快速血浆反应素环状卡片试验排除梅毒活动期，选用TPPA和CLIA进行复核，以TP-WB为金标准确证方法。CMIA法试剂说明书中，以S/CO值(样本RLU/cut-off RLU)≥1检验结果解释TP抗体检测呈反应性，S/CO值<1检验结果解释TP抗体检测呈非反应性；快速血浆反应素环状卡片试验测定梅毒非特异性抗原，是检测梅毒现正感染和疗效监测的指标。快速血浆反应素环状卡片试验阳性反应判读可见中等或较大的黑色凝块，溶液清亮；阴性反应判读可见均匀的抗原颗粒而无凝集物。TPPA和CLIA为TP特异性抗体复检方法(TPPA阳性反应判读产生均一的凝集，颗粒铺满整个孔底边缘不均匀且杂乱地凝集在周围，整体上呈膜状延展；阴性反应判读反应物集中于孔底，成纽扣状聚集，边缘光滑的圆形。CLIA S/CO值≥1检验结果解释TP抗体检测呈反应性，S/CO值<1检验结果解释TP抗体检测呈非反应性)。TP-WB为实验室平行试验的金标准，检测方法中重组TP基因蛋白抗原采用TPN47、tmpA(TPN45)、TPN17、TPN15的IgG抗体，是测定的血清特异性抗体。检测膜条置于全自动免疫印迹仪EUROBlotMasterll检测，通过EUROLineScan软件对检测结果进行判读，至少两条特异性抗原带明确显色，测试判读阳性；一条特异性抗原带明确显色，测试判读可疑阳性。EUROLineScan软件判读结果标准为着色强度≥24判定有反应性，检测线性范围为0～255。

1.4统计学方法 采用Graphpad Prism 8 Contingency table analyses组件的χ2检验进行不同诊断方法的差异分析；相关性分析采用Excel 2016进行散点最小二乘拟合，得到线性关系式并计算相关系数。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.14种梅毒实验室方法检测结果比较 130例CMIA初筛梅毒检测的S/CO值为1～9弱反应性样本，以CLIA复核，92例阳性，38例阴性，与CMIA相比，灵敏度为0.586，特异度为1.000，差异有统计学意义(χ2=44.532，P<0.001)；以TPPA复核，98例阳性，32例阴性，与CMIA相比，灵敏度为0.570，特异度为1.000，差异有统计学意义(χ2=36.491，P<0.001)；TPPA复核结果和CLIA方法相比，灵敏度为0.516，特异度为0.543，差异无统计学意义(χ2=0.704，P=0.402)；以TP-WB平行检测作为确证方法，40例反应性结果，其中8例阳性，32例可疑阳性，90例阴性，与CMIA相比，灵敏度为0.942，特异度为1.000，差异有统计学意义(χ2=229.943，P<0.001)。以TP-WB梅毒血清方法学为金标准，CLIA法灵敏度为85.0%，特异度35.6%；TPPA法灵敏度为85.0%，特异度为28.9%。见表1。

表1 CLIA、TPPA和TP-WB检测TP抗体的结果 (例)

CLIA：化学发光免疫分析；TPPA：梅毒螺旋体颗粒凝集试验；TP-WB：梅毒螺旋体免疫印迹试验；TP：梅毒螺旋体

2.2CMIA与CLIA法的相关性分析 130例弱反应性结果分别采用CMIA及CLIA法复核，相关性分析显示CMIA与CLIA法结果呈正相关(r=0.588，P<0.001)。见图1。

图1 CMIA与CLIA法相关性分析

2.3TP-WB确认结果抗体表达 40例TP-WB确认结果显示判读8例阳性结果，抗体表达为2个条带并着色强度低；32例判读可疑阳性结果，抗体表达单一且着色强度明显降低。见表2。

3 讨 论

近年来，梅毒在我国的感染率呈逐年上升趋势[9]，对我国的公共卫生事业有很大影响[10]，国家卫生行政部门越来越重视，患者本身意识越来越高。然而在临床工作中，实验方法存在差异性。文献报道，对于TP特异性抗体筛查阳性而甲苯胺红不加热血清试验检测阴性的老年患者需进行TP-WB

表2 40例标本免疫印迹检测结果不一致的汇总 (例)

CMIA：化学发光微粒子免疫分析法；CLIA：化学发光免疫分析；TPPA：梅毒螺旋体颗粒凝集试验；TP-WB：梅毒螺旋体免疫印迹试验；TP：梅毒螺旋体；-∶阴性；+∶阳性；±∶可疑阳性

确证检测并结合临床症状、体征和病史，做出最后诊断[11-12]。研究发现，TP感染会导致机体产生两类抗体：一类为抗TP的特异性抗体，是宿主针对TP多种膜蛋白或轴丝抗原等成分产生；另一类为非特异性血清反应素抗体，即抗心磷脂抗体，在TP感染过程中抗心磷脂抗体表达增加，随着治疗的进行其水平会降低，临床常用血清学方法检测抗心磷脂抗体滴度反映梅毒疾病活动性[13]。梅毒抗体无免疫保护作用，在临床上仅用于梅毒血清学的诊断[13]。TP感染机体后，宿主最早产生的抗体是IgM，然后是IgG和IgA。由于IgM变化比较明显，故临床常将其作为梅毒血清学诊断的标志物[14]；IgG抗体是体液免疫应答产生的主要抗体，在二期梅毒中表达最强烈，是血清和细胞外液中最主要的抗体成分[15]。人体感染TP 4～10周后，血清中会产生非TP抗体，即抗心磷脂抗体，其产生机制尚不清楚，一般认为是因为细胞受到损伤，线粒体释放心磷脂，作为抗原刺激机体免疫系统产生相应抗体；也有学者认为是因为TP本身具有心磷脂，所以引起抗心磷脂抗体的产生[16]。经规范治疗后，反应素可以逐渐减至阴性，但梅毒特异性抗体IgG不易消退，甚至终身阳性；未经治疗的梅毒患者，反应素会在体内长期存在[17]。研究发现，辅助性T细胞2介导的体液免疫应答是造成梅毒长期潜伏感染的主要原因[18]。梅毒外膜蛋白是免疫的主要靶点，TP15、TP17、TP45、TP47被认为在梅毒的诊治中起重要作用[19]。有研究表明，TP47是含量较高的外膜脂蛋白，具有较强的免疫原性和反应性；TP17可以激活内皮细胞[20]，能刺激机体产生强烈的抗体反应[21]，在TP免疫致病机制中具有重要作用。

但当结果为弱反应性，梅毒实验方法检测存在结果不一致时首先要考虑生物学假阳性反应或生理因素的影响。梅毒血清学检测生物学假阳性见于自身免疫性疾病、病毒性感染性疾病、心血管性疾病、肿瘤、炎症患者及生理情况孕妇、老年人等。文献报道，老年人群出现生物学假阳性的原因可能为随着年龄的增加，生理功能退化，基础疾病增多，机体产生了自身抗体、抗类脂抗体或异常蛋白，也可能存在其他螺旋体亚型的感染，使TP抗体检测出现交叉反应，从而产生生物学假阳性[22-27]。张晓红等[28]研究显示，97份TPPA检测阴性血清样本，TP-WB确证反应性结果占25.8%,TPPA是采用针对TP15、TP45抗体纯化的致病性TP抗原，所以TP15、TP45的抗体效价降低或仅有TP17、TP47抗体时，TPPA可能会无法正确得出阳性结果。

本研究回顾性分析130例弱反应性的梅毒患者中，孕妇人群、老年人群、患有基础疾病特殊人群(年龄集中在45～60岁)等的CMIA、CLIA、TPPA检测结果不一致，梅毒筛查实验方法学不同厂家应用抗原成分及人群分布会导致检测结果的假阳性、假阴性。本研究CMIA与CLIA法的相关性分析表明，两种方法检测结果存在高度一致性，同时出现假阳性的可能性较高。因此，即使两种方法结果均呈现较高的阳性值时也需采用特异性和稳定性更好地方法进行确证。目前，梅毒检测中大部分实验室以TPPA进行补充复核，但易导致临床诊断的误诊或漏诊。本研究结果显示，以TP-WB检测方法确证，阳性结果抗体表达为2个条带并着色强度低，可疑结果中抗体表达单一着色强度明显降低；TPPA阴性人群中TP-WB抗原带显示仅为一个条带，着色强度在检测的线性范围下限。

综上所述，临床主要通过检测患者血清学特异性抗体和非特异性抗体水平作为梅毒诊断及预后评估的实验室检测方法。免疫印迹检测TPN15、TPN17、TPN45、TPN47抗体在弱反应人群梅毒血清检测结果中以可疑阳性多见，故梅毒实验室临床确证在临床诊断中对于弱反应人群尤为重要。