补饲大熊猫幼仔奶粉的气味特点与香气成分研究

鲜义坤1,2,王承东,林俊帆1,李 果,李裕冬1,孔 凌5,熊铁一1,张贵权

(1.四川省自然资源科学研究院,四川 成都 610041;2.峨眉山生物资源实验站,四川 峨眉山 614201;3.大熊猫国家公园珍稀动物保护生物学国家林业和草业局重点实验室,四川 卧龙 623006;4.中国大熊猫保护研究中心,四川 卧龙 623006;5.成都大帝汉克生物科技有限公司,四川 成都 611130)

大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)属世界生物多样性保护成功的珍稀动物。“育幼存活难”是大熊猫人工繁殖过程中的三大难题之一,虽然获得一些技术突破,但仍在不断完善。在大熊猫繁育过程中,50%左右的妊娠母兽1胎产2仔,极个别的妊娠母兽产3仔[1],泌乳量难以满足2—3仔快速生长发育需要；有的母兽分娩后弃仔、不会哺乳，需用其他动物乳汁或奶粉进行人工喂养或补饲。选择既诱食(香气)又喜食(滋味、质地)还能满足幼仔营养需要的乳汁或奶粉已成为人工育幼的关键技术之一,因此有必要探究大熊猫幼仔喜食物的香气及其呈香物质。

电子鼻又称气味扫描仪,根据仿生学原理制成,用于检测样品中挥发性成分整体的气味信息;顶空(HS)—固相微萃取(SPME)—气相色谱(GC)—质谱(MS)联用技术是当今国内外分析样品中未知混合型挥发性有机物质(VOCs)的主流方法。部分学者用电子鼻技术检测过牛奶粉[2]、羊奶粉[3]、婴儿奶粉[4]中的挥发性成分,用HS-SPME-GC-MS法分析过羊乳[5]、牛乳[6,7]、猪乳[8,9]、羊奶粉[10-12]、牛奶粉[12]、驴奶粉[13]中的风味物质,为本研究提供了可供参考的方法。我们曾用非极性毛细管色谱柱对大熊猫幼仔补饲两种奶粉的挥发性成分进行过初步分析,但探寻出的VOCs和香气成分数量不及预期[14]。本文改用强极性毛细管色谱柱等HS-SPME-GC-MS方法中的关键技术节点,采用电子鼻技术,再结合专业人员的嗅感品评进一步研究这两种奶粉的气味特点与香气成分,旨在从补饲奶粉中探寻大熊猫幼仔喜食物的气味韵调、整体气味信息和更多的香气物质,为筛选大熊猫幼仔专用诱食剂原料提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供测奶粉

供测奶粉为两种:奶粉A,为美国某企业生产;奶粉B,为我国某中外合资企业生产,属婴儿配方奶粉,适用于喂养0—6月龄的婴儿。这两种奶粉均在中国大熊猫保护研究中心(简称“大熊猫中心”)用于补饲大熊猫幼仔多年。奶粉A样品采自大熊猫中心卧龙神树坪基地,奶粉B从成都市某超市购买,与大熊猫中心卧龙神树坪基地饲喂的品牌、型号和适用月龄一致。首先，将样品置入已清洗干净并经湿热高温灭菌除味(高温→室温→高温,热冷间歇,重复3次)的10mL棕色玻璃瓶中,旋紧瓶盖,再用无味的封口膜缠绕瓶盖与瓶颈结合处数圈密封,防止奶粉气味散失和环境气味串入,置于-20℃冰箱中保存待测。

1.2 分析仪器

表1 PEN3型电子鼻传感器信息

1.3 香气品评方法

称取1.0g奶粉置入干净无味的50mL的烧杯中,由长时间从事饲料或食品调味剂工作的专业人员通过嗅觉感知和辨别奶粉散发出的香气韵调与强弱等,描述并记录嗅辨结果。品评小组由6名人员(其中女性3名)组成,平均年龄43岁,无嗅觉疾患和临床感冒症状,在适宜的室内环境中(室温24—25℃,自然气压与湿度)品评,最后由品评小组负责人对嗅辨结果进行汇总、分析并确定奶粉中的香气特点。

1.4 电子鼻测试方法

准确称取0.700g奶粉(精确至0.001g)置入干净无味的烧杯中,再加入14.0mL温水(纯净水),搅拌至完全溶解后,准确地量取5mL奶液置入20mL干净无味的样品瓶中,迅速将带有密封垫圈的瓶帽旋紧,室温下平衡1.5h后,直接将进样针头插入样品瓶,采用顶空吸气法测试。完成一次检测后待系统自动清零和标准化后再进行第二次顶空采样,每个样品平行测定3次。测试参数为样品准备时间5s、检测时间180s、测量计数1s、自动调零时间5s、清洗时间90s,内部流量400mL/min、进样流量8mL/min。所得数据经仪器自带软件Winmuster和Origin pro 2018自动统计分析。

1.5 HS-SPME-GC-MS方法

HS-SPME方法:称取2.0g奶粉置入20mL的顶空瓶中,迅速用密封垫和铝盖密封;将已老化的SPME纤维头(250℃下老化)插入顶空瓶,推出SPME纤维头至离奶粉平面约1cm处;将顶空瓶与SPME纤维头置于电热恒温水浴锅内,固定,70℃或80℃温度下分别顶空萃取1h;拔出SPME纤维头后快速插入GC进样口,推出SPME纤维头解吸。

GC-MS方法:按相关文献[15]中的测试方法二进行仪器分析。

2 结果与分析

2.1 两种补饲奶粉的香气品评

奶粉A的香气韵调描述:淡淡的奶香气,略带乳脂香和奶腥气；微弱的青香气,甜度明显；有人嗅辩出豆香气、发酵样酸香气。奶粉B的香气韵调描述:较淡的奶香气,略带乳脂香,奶腥气突出。相对而言,奶粉A的香气韵调较多、浓度较强、腥气较淡、甜度明显、气味扩散性较好但持久性较差;奶粉B的香气韵调较少、浓度较淡、腥气突出、气味扩散性较差但持久性较好。

2.2 两种补饲奶粉的电子鼻测试结果

传感器响应值:从图1和图2可见,奶粉A和奶粉B的响应曲线存在明显不同,奶粉A在R2和R7传感器上的响应峰值均明显低于奶粉B。当连续吸附40s以后,奶粉A在R6传感器上的响应值最高,且一直持续到测试结束;而奶粉B在吸附100s后R6传感器的响应值才达到最高。当180s测试结束时,奶粉A响应值排前三位的传感器依次为R6、R8和R2,奶粉B依次为R6、R7和R2。从表1可见,奶粉A和奶粉B的挥发性成分存在部分差异。

图1 奶粉A的电子鼻响应曲线

图2 奶粉B的电子鼻响应曲线

从图3可知,180s时奶粉A和奶粉B在R1、R2、R3、R5、R9、R10传感器上的响应值差异均较小,但奶粉A在R4、R6、R8传感器上的响应值均高于奶粉B,奶粉B仅R7传感器上的响应值高于奶粉A。从表1可见,这两种奶粉中挥发性成分差异的主要贡献物质类别为氢化物、甲基类、无机硫化物、萜烯类、醇类、酮类和醛类。

主成分分析(PCA):PCA分析是降低数据维度和解决多重共线性问题最常用的多变量统计方法,其原理是利用降维思想,通过研究指标体系内在结构之间的关系,把多指标转化为少数几个相互独立且包含原有指标大部分信息的综合指标。

据中国农业科学院最新消息，中国水稻研究所种质创新团队发现一种新型水稻种质“小薇”，可以像双子叶模式植物拟南芥一样，在实验室内大规模种植和筛选。相关研究成果在线发表于《分子植物》杂志上。

图3 奶粉A和奶粉B的电子鼻雷达图

从图4可见,奶粉A和奶粉B的电子鼻数据信息点所在的椭圆区域分别位于图中的不同区域,说明PCA法可用于对这两种奶粉中挥发性成分的识别分析。第一主成分(PC1)贡献率为74.58%,第二主成分(PC2)贡献率为24.20%,累积贡献率高达98.78%,表明前两个主成分所代表的信息能完整反映样品的整体气味信息,奶粉A和奶粉B在PC2上存在较大差异。这两种奶粉所在区域没有交叉重叠,彼此独立成簇且相互有一定的距离,表明两种奶粉的整体气味信息差别显著,PCA法能将其准确区分。

图4 奶粉A和奶粉B的电子鼻PCA分析

线性判别分析(LDA):LDA分析是在PCA分析的前提下将挥发性物质的响应信号进行进一步优化处理,与PCA分析的主要区别在于LDA分析更注重同类别组分在空间中的分布状态和彼此之间的距离,将数据之间的差异性进一步扩大,可提高分类精度。

从图5可见,奶粉A和B的LD1与LD2贡献率分别为99.63%和0.05%,累积贡献率高达99.68%,能较好地反映样品的整体气味信息。这两种奶粉的空间分布均无任何重叠,且相距较远,差异主要在LD1上,表明两种奶粉的气味信息差别较大,可见利用电子鼻中的LDA模式能准确识别其整体气味信息的差异。

图5 奶粉A和奶粉B的的电子鼻LDA分析

载荷分析(LA):不同传感器在LA分析图中的不同位置可反映传感器对样品气味贡献的大小,距离原点越远,表示此传感器在挥发性成分分析中所起的作用越大;反之,说明该传感器的贡献越小。

从图6可见,对第一主成分贡献较大的传感器为R6,其他依次为R7、R8和R1;对第二主成分贡献较大的传感器为R2,其余依次为R8和R7;R3、R4、R5、R9、R10传感器对第一主成分和第二主成分的贡献率均较小,因为集中分布在0点附近,可见这5个传感器所对应的挥发性物质在这两种奶粉中差异均较小。从表1可知,这两种奶粉的主要挥发性化合物类别可能为:甲基类、醇类、醛类、酮类、无机硫化物、萜类、氮氧化物、芳香类,这些类别的挥发性成分构成了这两种奶粉的整体气味信息,可能因为它们含量不同，导致其整体气味呈现较大差异。

图6 奶粉A和奶粉B的电子鼻LA分析

2.3 两种补饲奶粉中的VOCs和香气成分

奶粉A中的VOCs:经70℃ HS-SPME预处理1h和GC-MS测试,奶粉A中的VOCs组成见图7、表2。从图7和表2可见,确定(匹配度≥80%,下同)的VOCs有76种,分别归类于醇14种、酚1种、醛6种、酮6种、羧酸6种、酯1种、内酯3种、烷烃2种、烯烃4种、芳香烃29种、含硫化合物3种、杂环化合物1种,相对含量排前五位的VOCs为己醛(10.95%)、2-丙醇(6.32%)、1,3-二甲基苯(5.18%)、丙酮(4.56%)、α-蒎烯(4.18%),累计为31.19%。经80℃ HS-SPME预处理1h和GC-MS测试,奶粉A中的VOCs组成见图8、表2。从图8和表2可见,确定的VOCs有87种,分别归类于醇12种、酚1种、醛10种、酮7种、羧酸7种、酯3种、内酯3种、烷烃2种、烯烃5种、芳香烃27种、含硫化合物4种、杂环化合物6种,相对含量排在前五位的VOCs分别为己醛(11.22%)、戊醛(5.20%)、2-丙醇(4.76%)、丙酮(3.73%)、1,3,5-三甲基苯(2.99%),累计为27.90%。

图7 奶粉A经70℃ HS-SPME处理1h的VOCs总离子流色谱图

图8 奶粉A经80℃ HS-SPME处理1h的VOCs总离子流色谱图

表2 奶粉A中的VOCs

(续表2)

序号VOCs名称70℃ HS-SPME 1h80℃ HS-SPME 1h保留时间(min)匹配度(%)相对含量(%)保留时间(min)匹配度(%)相对含量(%)家畜乳汁与奶粉中被检出的文献与奶粉B异同成分6癸烷———4.418900.84[12,13]√7α-蒎烯4.475964.184.916962.16[9]×8三氯甲烷4.654920.745.135780.96[6,10,11]×9甲基苯4.933943.935.463942.15[7,9,13]×104-甲基十二烷———5.697800.50×11二甲基二硫醚5.639941.086.334971.00×12己醛5.8149510.956.5929311.22[7-9,12,13]√13β-蒎烯6.291901.947.055911.74[9]×14乙基苯6.873931.847.821930.83[6,10,11,13]×151,4-二甲基苯7.043951.438.060971.03[6,8-10,13]×161,3-二甲基苯7.217955.188.259972.97[9,11]×171-丁醇7.316640.308.498900.88×182-庚酮———9.66791—[7,10,12,13]√191,2-二甲基苯8.356953.669.762952.15×20庚醛———9.826831.84[12,13]√21十二烷8.520930.41———[6,8,10,12,13]√22d-柠檬烯8.600970.9610.130981.08[13]×232-宁烯8.84991————×24β-水芹烯———10.44391—×25丙基苯8.973900.5910.608870.35×26吡嗪———10.82680—×272-己烯醛———11.025940.08×281-乙基-2-甲基苯9.401952.2111.130950.41×292-戊基呋喃9.590910.6411.568910.56[12,13]√301,2,4-三甲基苯9.903971.1811.926950.94[11]×311-戊醇10.117902.5912.389902.21[7,12]√32苯乙烯10.34194—12.553941.43[6,10,11]×331-乙基-4-甲基苯10.381861.38———×341,3,5-三甲基苯10.923973.0913.364972.99×35辛醛———13.797811.07[7]×363-羟基-2-丁酮11.222831.43———[6,7]√371-甲基-3-丙基苯11.505900.7614.254930.84×382-乙基-1,4-二甲基苯———15.120960.66×391-乙基-3,5-二甲基苯12.083960.75———×40顺式-2-戊烯-1-醇———15.255900.43×411,2,3-三甲基苯12.401951.1915.583971.08×422-甲基-3-戊醇12.749830.49———×431-甲基-4-(1-甲基乙基)苯12.844940.2416.260950.36[8,9]×441-己醇12.904830.4316.543720.81×451-乙基-2,3-二甲基苯13.018950.45———√464-乙基-1,2-二甲基苯13.237970.6016.842961.12×47二甲基三硫醚———17.389870.11×48乙酸-2-乙基己酯13.645830.3017.633910.20×492-壬酮———17.787870.48[6,7,10-13]√50壬醛13.937910.3618.011810.88[6,7,12,13]√511-苯基-1-丁烯14.014860.33———×523-辛烯-2-酮14.302900.7518.543900.84[12,13]×531,2,4,5-四甲基苯14.725970.4419.101970.48[6]×54反式-2-辛烯醛———19.42983—[9,12]×551,2,3,5-四甲基苯15.003970.7519.553970.85×561,3-二氯苯15.307950.2720.041950.25×571-辛烯-3-醇15.466900.3020.558800.35[12]√581-庚醇15.575800.1920.67390—×593-甲硫基丙醛15.670930.1920.722930.48×602,3-二氢-5-甲基-1H-茚———21.066900.28×61呋喃甲醛15.958910.5821.155910.53[6,7,13]√622,3-二氢-4-甲基-1H-茚16.01891————×

(续表2)

序号VOCs名称70℃ HS-SPME 1h80℃ HS-SPME 1h保留时间(min)匹配度(%)相对含量(%)保留时间(min)匹配度(%)相对含量(%)家畜乳汁与奶粉中被检出的文献与奶粉B异同成分631,2,3,4-四甲基苯16.362950.3421.583950.62×642-乙基-1-己醇16.451862.6922.076861.87[7,12,13]×65乙酸16.51187—22.131871.41[6-11]√661-异丙基-2,4-二甲基苯———22.742930.16×671-甲基-2,3-二氢茚16.675910.39———×683,5-辛二烯-2-酮17.212901.8422.917912.45[13]×69苯甲醛17.376970.5623.056961.06[6,7,10-13]√70(R,R)-2,3-丁二醇17.83486—23.89280—×711,5,6,7-四甲基双环[3.2.0]庚-2,6-二烯———24.19492—×72甲酸辛酯———24.28591—×731-辛醇18.133870.1224.290910.24√74反式,反式-3,5-辛二烯-2-酮18.426871.1924.534901.67[12]√75丙酸18.561940.4524.842950.26[7]√762,3-丁二醇18.745900.1625.06683—√771,2-丙二醇19.118900.4625.529910.47×782,3-二氢-4,7-二甲基-1H-茚19.227860.3926.067950.14×79γ-丁内酯———26.35593—[7]√801,2,3,4,5-五甲基苯———26.55995—×81苯乙酮20.456900.2726.952900.53√82丁酸20.600911.8927.305911.42[6-11]√832-呋喃甲醇20.770950.3327.474970.46[9,10,13]√84α-甲基苯甲醇21.237870.14———[10,11]×852,7-二甲基氧杂环庚三烯———27.907900.19×86γ-己内酯21.635910.1228.305780.17×87萘22.426951.0129.161951.65[6-8]√88戊酸23.078830.2930.061800.37[7,10,11]√89δ-己内酯23.630810.1730.524900.12×901-甲氧基-4-(1-丙烯基)苯24.32790—31.350970.06×912-甲基萘24.810970.3731.798960.77[6,7,13]×92己酸25.352901.1032.484902.07[6-11]√93苯甲醇25.496830.07———[10,11]√941-甲基萘25.586970.1832.634960.55[6,8,10,11]√95二甲基砜26.098961.2233.231960.91[6,7,10-12]√96δ-辛内酯27.25390—34.410950.08[12,13]×97麦芽酚27.332580.1234.519940.22[7,9]√98苯酚28.287940.1135.524940.05[6,7,10,11]√99辛酸———36.858900.05[5-7,9-13]√1004-甲基-5-噻唑乙醇———40.111930.09×101苯甲酸37.228950.2142.982960.16[6,7,10,11]√102烟酰胺———47.485970.27√

注:未列出70℃和80℃ HS-SPME预处理1h后测出的匹配度均小于80%的成分,—表示仪器未检出或未自动算出,×表示奶粉A与奶粉B不同的成分,√表示奶粉A与奶粉B相同的成分,表3同。

奶粉A的上述两次测试均为同一人员操作,并在同日经同一仪器检出的结果,VOCs数量及其相对含量的差异可能是不同的HS-SPME温度所致。HS-SPME温度升高可使样品中的VOCs扩散加速,有利于增强SPME纤维头对VOCs的吸附效果,所以在80℃ HS-SPME预处理下测出的VOCs比在70℃ HS-SPME预处理下多11个。若将70℃和80℃ HS-SPME两个预处理的GC-MS测试数据合并,奶粉A中可确定的VOCs达102种(未计相互之间的重复成分,下同),分别归类于醇16种、酚1种、醛10种、酮8种、羧酸7种、酯3种、内酯4种、烷烃4种、烯烃6种、芳香烃33种、含硫化合物4种、杂环化合物6种,可见奶粉A中的VOCs是以芳香烃类、醇类、醛类、酮类、羧酸类为主,其中52种(占总数的51.0%)VOCs曾在家畜乳汁[5-9](羊乳或牛乳或猪乳,下同)或奶粉[10-13](羊奶粉或牛奶粉或驴奶粉,下同)中检出,即已确定成分的相同度为51.0%,说明奶粉A与家畜乳汁或奶粉之间既有相同的成分,又存在50种VOCs的较大差异,可能导致奶粉A与家畜乳汁或奶粉在香气韵调上既有相同,又有不同。若将奶粉A两次测试的相对含量排前五位者合并进行算术平均计算,则其中平均相对含量排前五位的VOCs为己醛(11.09%)、2-丙醇(5.54%)、戊醛(4.34%)、丙酮(4.15%)、1,3-二甲基苯(4.08%),累计为29.20%,这些成分可能对奶粉A中主要香气韵调的形成发挥了重要作用。

奶粉B中的VOCs:经70℃ HS-SPME预处理1h和GC-MS测试,奶粉B中的VOCs组成见图9、表3。从图9和表3可见,确定的VOCs有57种,分别归类于醇6种、酚1种、醛8种、酮7种、羧酸9种、酯1种、内酯1种、烷烃17种、烯烃1种、芳香烃1种、含杂环化合物4种、含硫化合物1种,相对含量排在前五位的VOCs分别为丁酸(7.59%)、2,4,6-三甲基辛烷(4.76%)、2,6,11-三甲基十二烷(4.64%)、乙酸(4.52%)、2-呋喃甲醇(3.94%),累计为25.45%。经80℃ HS-SPME预处理1h和GC-MS测试,奶粉B中的VOCs组成见图10、表3。从图10和表3可见,确定的VOCs有55种,分别归类于醇8种、醛5种、酮9种、羧酸10种、内酯1种、烷烃11种、烯烃1种、芳香烃3种、杂环化合物4种、含硫化合物1种、含氮化合物2种,相对含量排前五位的VOCs为丁酸(10.38%)、己酸(7.80%)、己醛(5.05%)、3,6-二甲基癸烷(4.60%)、辛酸(4.39%),累计为32.22%。

图9 奶粉B经70℃ HS-SPME处理1h的VOCs总离子流色谱图

图10 奶粉B经80℃ HS-SPME处理1h的VOCs总离子流色谱图

表3 奶粉B中的VOCs

(续表3)

序号VOCs名称70℃ HS-SPME 1h80℃ HS-SPME 1h保留时间(min)匹配度(%)相对含量(%)保留时间(min)匹配度(%)相对含量(%)家畜乳汁与奶粉中被检出的文献与奶粉A异同成分22庚醛9.816860.518.364720.39[12,13]√23十二烷10.110962.188.528971.59[6,8,10,12,13]√242-戊基呋喃11.548950.799.597940.60[12,13]√254-甲基十四烷———9.697862.43×261-戊醇———10.130901.00[7,12]√271-乙基-2,3-二甲基苯———10.617910.26√28十五烷———11.433800.20[6,10-13]×295-乙基-2-甲基辛烷11.836803.17———×30甲酸戊酯12.379831.04———×31十九烷12.648800.47———×323-羟基-2-丁酮13.827801.22———[6,7]√331-羟基-2-丙酮14.478863.0611.647802.72[7]×34反式-2-庚烯醛15.070950.3212.105970.78×356-甲基-5-庚烯-2-酮15.63393—12.483920.19[7]×362-环戊烯-1-酮16.195900.2813.011870.23×372-壬酮———13.80283—[6,7,10-13]√38壬醛17.543901.5313.931911.43[6,7,12,13]√39N,N-二甲基乙酰胺———14.225860.50×40二十二烷———15.031830.41×411-辛烯-3-醇19.464860.5915.468900.58[12]√42呋喃甲醛19.966860.4615.971910.55[6,7,13]√43乙酸20.693914.5216.528912.17[6-11]√44反式,反式-3,5-辛二烯-2-酮———17.210870.17[12]√45苯甲醛21.519900.5117.384930.43[6,7,10-13]√46反式-2-壬烯醛21.75786————×471-辛醇22.459900.4218.125910.42√48丙酸22.917951.0318.548980.52[7]√492,3-丁二醇———18.767870.54√502,2-二甲基丙酸23.787910.83———[10]×51γ-丁内酯24.34591—19.991970.16[7]√52苯乙酮24.842900.4220.434910.32√53丁酸25.076947.5920.5989110.38[6-11]√542-呋喃甲醇25.250973.9420.757974.03[9,10,13]√55α-松油醇25.937910.2621.429900.20[9]×565-甲基-2-呋喃甲醇———22.120940.10×57萘———22.439940.49[6-8]√58戊酸27.643860.8123.071860.65[7,10,11]√592-羟基-2-环戊烯-1-酮27.85790—23.280900.12×601-甲基萘29.41590—24.841950.23[6,8,10,11]√61己酸29.987902.2825.354907.80[6-11]√62苯甲醇30.096950.3725.494970.13[10,11]√63二甲基砜30.698963.4826.106962.63[6,7,10-12]√64麦芽酚31.952860.3227.335930.59[7,9]√65苯酚32.91780————[6,7,10,11]√66庚酸———27.514900.29[5,6,10,11]×67辛酸34.236870.2429.579974.39[5-7,9-13]√681,6-己内酰胺35.833970.4131.459970.29[10,11]×69壬酸35.892900.2731.564960.57[5-7,10,11]×70癸酸———33.454960.15[5-7,9-13]×71苯甲酸40.330800.3237.231930.21[6,7,10,11]√72N-甲基二乙醇胺———37.515800.43×73烟酰胺44.813950.4441.868950.43√

奶粉B的上述两次测试均如奶粉A一样由同一人员操作并在同日经同一仪器检出的结果,VOCs数量及其相对含量的差异可能是不同的HS-SPME温度所致。在80℃ HS-SPME预处理下测出的VOCs比在70℃ HS-SPME预处理下少了2个,与相关文献[16]报道70℃和80℃ HS-SPME预处理的羊奶检出结果是基本一致的。若将70℃和80℃ HS-SPME两个预处理的GC-MS测试数据合并,奶粉B中可确定的VOCs达73种,分别归类于醇9种、酚1种、醛8种、酮10种、羧酸11种、酯1种、内酯1种、烷烃21种、烯烃1种、芳香烃3种、杂环化合物4种、含硫化合物1种、含氮化合物2种,可见奶粉B中的VOCs以烷烃类、羧酸类、酮类、醇类、醛类为主,其中45种(占总数61.6%)VOCs曾在家畜乳汁或奶粉中检出,说明奶粉B与家畜乳汁或奶粉之间既有相同的成分,又存在28种VOCs的差异,可能导致奶粉B与家畜乳汁或奶粉在香气韵调上既有相同,又有不同。若将奶粉B两次测试的相对含量排前五位者合并进行算术平均计算,则其中平均相对含量排前五位的VOCs为丁酸(8.99%)、己酸(5.04%)、己醛(4.45%)、2-呋喃甲醇(3.99%)、3,6-二甲基癸烷(3.67%),累计为26.14%,这些成分可能对奶粉B中主要香气韵调的形成起到了重要作用。

表4 补饲大熊猫幼仔用的两种奶粉香气成分异同分析

注:※表示在圈养大熊猫乳汁中测出[15]。

两种奶粉中VOCs与香气成分的异同分析:由表2与表3对比可知,奶粉A的VOCs比奶粉B多29种,奶粉A与奶粉B之间相同的VOCs有36种,奶粉A不同于奶粉B的VOCs有66种,奶粉B不同于奶粉A的VOCs仅37种,奶粉A与奶粉B互不相同的VOCs多达103种,可见这些差异可能是两种奶粉间在香气韵调和强度上不同的直接物质原由,验证了上述专业人员的香气品评结果,并与上述电子鼻的测试结果相吻合;且这两种奶粉的VOCs数量与文献报道[5-14]的家畜乳汁及其奶粉之间都存在部分异同(表2、表3),可能是因为用于加工奶粉的乳汁来自不同的动物种类、或是添加了其他非乳源性原料或添加的种类和比例不同、或乳源动物种类相同而日粮组成和代谢类型不同,以及奶粉的生产工艺流程不同和VOCs分析方法不同如色谱柱的极性强弱[14]、SPME纤维头的不同型号[14,17]等所致。

香气韵调虽然与VOCs数量及其浓度密切相关,但能起到关键作用的挥发性物质是其中的香气成分数量及其浓度,因为香气成分属于VOCs大类中的一部分。由表4可知,奶粉A中的香气成分有58种,分别归类于醇12种、酚1种、醛10种、酮8种、羧酸7种、酯3种、内酯4种、烃6种、含硫化合物3种、杂环化合物4种,这些成分对奶粉A中香气韵调的形成可能起到主要或主导作用,其中41种香气成分(占总数的70.7%)在家畜乳汁或奶粉中检出,17种(占总数29.3%)未在家畜乳汁或奶粉中检出(表2),即已确定成分的不同度为29.3%;22种香气成分(占总数的37.9%)曾在大熊猫乳汁中测出,36种(占总数62.1%)未在其中测出(表4)。奶粉B中的香气成分有40种,分别归类于醇6种、酚1种、醛8种、酮8种、羧酸10种、酯1种、内酯1种、烃2种、杂环化合物3种,这些成分对奶粉B中香气韵调的形成可能起到主要或主导作用,其中34种(占总数85.0%)香气成分在家畜乳汁或奶粉中检出,仅6种(占总数的15.0%)未在家畜乳汁或奶粉中检出(表3);20种香气成分(占总数的50.0%)曾在大熊猫乳汁中测出,20种(占总数50.0%)未在大熊猫乳汁中测出(表4)。奶粉A的香气成分比奶粉B多18种,奶粉A和奶粉B相同的香气成分有28种,互不相同的香气成分达42种,据此推知这两种奶粉的香气韵调和强度存在异同,与上述的香气品评和电子鼻测试结果一致。从已确定香气成分的相同度而言,奶粉B(85.0%)比奶粉A(70.7%)更趋像家畜乳汁或奶粉,而奶粉A和奶粉B与圈养大熊猫乳汁中的香气成分相同度仅分别为37.9%和50.0%,可间接说明这两种奶粉的香气韵调和强度与圈养大熊猫乳汁存在差异。根据相关文献[17]，对表4中香气成分(单体呈香物质)的香气特征描述记载中可找到这两种奶粉中的香气韵调所对应的香气成分,某种香气韵调并非单独由1种香气成分引起,而是由多种单体呈香物质相互作用(协同增效或抵消减弱)的综合表象。

3 讨论

3.1 大熊猫幼仔喜欢的食物香气韵调

按一定比例用温开水调混后的奶粉饲喂大熊猫幼仔的最初几天,虽然幼仔不乐意吸食,但经过一段时间的风味适应,奶粉中的主要香气韵调逐渐被幼仔接受,奶粉是除母乳外的圈养大熊猫幼仔首先品尝并成为最喜爱的人类加工食品。根据已述及的两种补饲奶粉中的香气品评结果,再结合圈养大熊猫乳汁香气特征[18],大熊猫幼仔喜欢的食物香气韵调有:奶香气、甜气、乳脂香、奶腥气、青香气、酸香气。随着大熊猫幼仔嗅觉系统不断发育完善,感知和认知的食物与环境气味越来越多,喜欢的食物香气韵调也会不断拓展,无疑补饲奶粉A或奶粉B除增强营养物质供给外还有利于对幼仔嗅觉驯化,提升幼仔对安全性气味的识别能力。当然幼仔喜欢的某种香气韵调受其强度限制,香气强度过大,会引起幼仔产生厌倦;强度过小,不被幼仔感知,适宜的香气强度有待进一步深入探究。

3.2 HS-SPME-GC-MS法的关键技术节点

曾用50/30μm DVB/CAR/PDMS的SPME纤维头对奶粉A和奶粉B的复原乳(1.0g奶粉加5mL去离子水混匀)在50℃ HP-SPME预处理1h,经DB-5MS型毛细管色谱柱内置于QP2010Plus型的GC-MS联用仪分析,奶粉A中测出的VOCs有46种、香气成分14种;奶粉B中测出的VOCs仅有6种、香气成分也为6种[14]。本文又用75μm CAR/PDMS的SPME纤维头对这两种奶粉的原粉(2.0g)70℃和80℃ HP-SPME行预处理1h,经HP-INNOWax型毛细管色谱柱内置于Agilent 7890B-5977B型的GC-MS联用仪分析,奶粉A中测出的VOCs多达102种,香气成分58种;奶粉B中测出的VOCs 73种,香气成分也有40种。可见不同的SPME纤维头类型、供测样品气味强度、HP-SPME温度、毛细管色谱柱类型、GC-MS联用仪的生产厂家和新旧程度、谱库是否为最新版本、自动检索还是人工检索等关键技术节点的差异都有不同的测试结果。此外,HP-SPME时长、不同的程序升温、毛细管色谱柱长度、解吸时间长短、检测器的灵敏性高低等也是影响测试结果的关键技术节点。

3.3 应用建议

根据圈养大熊猫乳汁的青腥气突出[18]和本次奶粉香气的品评结果,在不比较奶粉A和奶粉B营养价值高低的前提下,仅就主要香气韵调而言,大熊猫幼仔在日龄较小时以补饲奶粉B为好,因为奶粉B的主要香气韵调不复杂,奶腥气突出,与母乳的主体香气韵调近似;在日龄较大时补饲奶粉A较好,因为奶粉A的香气韵调较多,可训练幼仔对食物中多种香气韵调的嗅觉感知和大脑认知,有助于幼仔断奶后凭借熟知的气味记忆对食物气味信息做出判断,决定是否采食或采食多少,可供制定奶粉A和奶粉B补饲大熊猫幼仔的先后顺序时参考。

奶粉A和奶粉B通过电子鼻测试,从响应曲线、雷达图、主成分分析、线性判别分析以及载荷分析得知,这两种奶粉的气味物质类别、整体气味信息等存在差异。应用电子鼻技术能准确识别这两种奶粉的整体气味信息差异,可用于掺假和溯源的快速鉴别检测。

在调制大熊猫幼仔专用诱食剂(仿制大熊猫乳源性化学信息素)时,若按从食物中来的成分,可添加到食品中去,表4中的70种不同香气成分均可作为单体香原料用于调制产品,除3,5-辛二烯-2-酮、乙酸-2-乙基己酯、苯乙烯外,其它香气成分均有国际上认可的、经过食品安全性试验或评估的FEMA编号。我国食品安全国家标准——《食品添加剂使用标准》(GB 2760-2014)中未允许在食品中添加使用的顺式-2-戊烯-1-醇、苯甲醇、5-甲基-2-呋喃甲醇、1-羟基-2-丙酮、3,5-辛二烯-2-酮、甲酸辛酯、乙酸-2-乙基己酯、1,6-己内酰胺共8种单体呈香物质,因此应严格遵照国家有关法规和标准的要求,酌情酌量、有针对性地筛选和应用。