即食食品中单增李斯特氏菌快速检测技术的研究进展

尤祯丹,陈传君,蒋玉涵,蒲春如,蒋 艳,杜娟兰,张白玉,严立恒,颜其贵,韩国全,*

(1.四川农业大学食品学院,四川雅安 625014; 2.四川农业大学食品加工与安全研究所,四川雅安 625014; 3.四川农业大学动物医学院,四川成都 611130)

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,LM)是一种人畜共患病原菌,感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多,也可导致孕妇流产、胎死宫内、新生儿死亡等[1-3]。该菌广泛存在于自然界中,对环境条件要求不高,是即食食品(Ready-to-eat,RTE)中威胁人类健康的主要病原菌之一[4]。因此,在食品微生物检验中必须加以重视。

即食食品由于其产品特性,该类食品很容易因为交叉污染等因素导致食源性病原菌的侵入。Iannetti等[5]收集了意大利不同类型的RTE产品,对2696个样本进行综合调查,包括软、半软干酪和熟肉制品,结果熟肉制品在实验室样品到达时污染率为1.66%,货架期结束时污染率为1.92%;干酪到达实验室时污染率为2.13%,货架期结束时为1.01%。Mehmeti等[6]检测了科索沃的产散装奶的牧场,从10个不同地区分布的221个农场共采集了603个储奶罐样本进行牛奶质量评估,单增李斯特菌污染率为2.7%,且所有检测出的菌株中毒力基因prfA、actA和hlyA均为阳性。近年来研究人员调查结果表明该菌在我国RTE食品中污染率在1%～10%,其中熟肉制品和凉拌菜污染率较高[7-11]。

与其他国家进行的调查相比,我国RTE食品中单增李斯特氏菌的流行率普遍相当。由于单增李斯特氏菌的危害性较大,对其有效且快速的检测至关重要,本文对近期研究出来的检测方法(分子生物学检测技术、免疫学检测技术、生物传感检测技术、光谱学检测技术等)进行阐述,为相关工作者后期开发更高效、快速、准确、便捷的检测方法提供新方向。

1 分子生物学检测技术

1.1 结合等温扩增技术

等温扩增是在等温条件下扩增靶核酸的方法,是一种快速、特异和敏感的方法,不需要昂贵的仪器,因此适用于资源不足的情况下的现场检测。Yan等[12]直接使用细菌培养物或菌落作为模板,在环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)之前没有任何DNA提取和纯化,针对毒力基因hlyA设计引物,包括正向和反向内部引物、外部引物和环状引物,反应过程和结果观察在内的总检测时间约为60 min,结果可视便于观察。

如今产物检测方式从电泳判定、浊度仪判定、目视浊度等方法向与传感器结合判定改变,结果可更加准确、直观。李秀梅等[13]针对hlyA基因设计了4条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素标记的探针,与横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD)联合应用,对反应引物进行荧光标记,反应产物在横向流动试纸条上完成显色和结果判读,该方法完成检测全过程仅需80 min,对纯细菌培养物的检测灵敏度为3.6 CFU/mL。黄梦琪等[14]构建了一种基于滚环扩增技术的纸基显色传感器用于可视化致病菌的检测平台,将酶切后的单链产物不经过预变性杂交,直接进行试纸条检测,在优化条件下检出限为100 pg/μL,整个试验过程可在几小时内完成。Wachiralurpan等[15]建立了新的LAMP-LFD方法,在90 min内得到结果,使用纯化的基因组DNA或来自纯培养物的细胞的测定的检测限分别为800 fg和2.82 CFU/mL,特异性试验表明该方法与四种李斯特氏菌及12种非李斯特菌属无交叉反应。Gao等[16]研究了一种重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)结合LFD,优化了引物和探针,检测时特异性高,整个分析从样品预处理到最终结果大约30 min。Wang等[17]使用多重交叉位移扩增(Multiple cross-displacement amplification,MCDA)标记金纳米粒子结合LFD,整个过程在1 h内完成,由于无需电泳、特殊试剂和检测仪器,温度控制在60～67 ℃即可,检测结果可以通过肉眼直接观察到,十分便捷。

1.2 结合聚合酶链式反应技术

有学者从提高细菌富集效率着手,采用不同纳米颗粒进行富集,可不同程度缩短检测时间。该方法反应时间较短,结果较为准确,灵敏度高,可同时检测多种病原菌,但是反应结束后还需与其他技术相结合来观测结果。Meng等[18]将万古霉素(Vancomycin,Van)固定在聚乙二醇纳米颗粒的表面可提高低浓度靶细菌的富集效率,而后与聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)结合检测,该方法的检出限为30 CFU/mL或g,总体测定时间不到4 h。Yang等[19]使用多价刷状磁性纳米探针对病原菌进行富集,该探针以聚L-赖氨酸、修饰胺基、万古霉素为骨架,可在2 min内产生高浓缩效率(>94%),结合PCR-电化学发光分析,该方法下可以在低至10 CFU/mL的水平下快速准确检测。

还有可以从特异性引物入手,结合不同种PCR技术同时对多种病原菌进行检测。Phraephaisarn等[20]提出基于编码两种假设蛋白的基因设计的特异性引物BE-Lis,与PCR扩增结合用于所有李斯特氏菌属物种的早期检测。Wang等[21]研究出基于金纳米粒子的常规寡核苷酸微阵列分析结合了金纳米粒子的多重寡核苷酸连接-PCR和银增强检测技术,该检测方法可以明确区分单一或多重感染八种病原菌,纯培养物的检测灵敏度为3.3～85 CFU/mL。Tao等[22]基于新型靶基因的多重PCR检测能够快速检测李斯特氏菌属,该方法的总检测时间短至16 h。Ding等[23]研究开发了新型多重实时PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)技术,在DNA提取和培养之前添加了富集步骤,相比于传统qPCR可降低检测限和检测时间,检测限为14 CFU/25 mL。Feng等[24]研发了新型双过滤基单叠氮丙啶(PMA)-多重PCR检测方法,该检测方法和滤膜法结合提高了LM的检测成功率,检测时间大约在6h左右。Witte等[25]评估了微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)的实际应用,使用ddPCR从纯的细菌培养物,人工污染的奶酪和天然污染的食物定量LM在相对宽的动态范围内的结果是可靠的。Cremonesi等[26]用ddPCR系统的性能与qPCR平行测试进行比较,它灵敏度更高,在食品基质中对于李斯特氏菌属物种测定为102CFU/g,检测时不需要预扩增步骤,并且比qPCR显示更高的精确度、灵敏度和可重复性,但是更加昂贵。Zeng等[27]用生物染料如单叠氮乙锭和PMA在DNA提取前对样品进行预处理,与qPCR相结合,结果表明PMA-qPCR可用于定量测定LM的活细胞,其中死细胞与活细胞的比例不超过104,活细胞的浓度不低于103CFU/mL。qPCR、ddPCR等新型技术结果更加精准,灵敏度更高,检测结果可直接显示,更加方便快捷,但是仪器昂贵,成本较高。

2 免疫学检测技术

除了从病原菌的核酸角度分析之外还从病原菌所特有的蛋白入手,结合免疫学方法进行检测。现在更倾向于与层析试纸条技术相结合,结果观测便捷。Wang等[28]提出了测定LM的侧流免疫层析试纸条法,制备P60蛋白肽的单克隆抗体(mAb)1C1,并用金纳米颗粒(Au Nanoparticles,AuNPs)标记,基于AuNP的条带检测可以检测8种常见血清型的LM,检测限为3.7×106CFU/mL,不与包括李斯特氏菌属在内的其他细菌发生交叉反应。Tominaga[29]比较了基于胶体钯纳米颗粒(PdNPs)和AuNPs的横流式试纸条测定法(Lateral flow test strip,LFTS)的灵敏度,PdNPs-辣根过氧化物结合LFTS法检测LM的灵敏度是基于AuNPs-LFTS测定法的5～10倍。

还可以试开发新型抗体,再结合不同种检测技术来进行试验,一般检测结果可直接观察,成本较低,十分便捷。Morlay等[30]开发了一种新型抗体来聚集金和磁性纳米颗粒,再通过表面增强拉曼散射(Surface enhanced raman scattering,SERS)检测病原体,这种方法尽管需要在每次运行中添加纳米颗粒,但在富集步骤成功地检测了污染样品,缩短了操作时间,检测时间在25 h以内,同时对于任何革兰氏阳性菌株或食物背景天然菌群没有观察到交叉反应。Liu等[31]开发了用于检测LM夹心型的酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法,检测的灵敏度为6.5 lg CFU/mL,可用作巴氏杀菌乳中该菌的快速检测。林婷婷等[32]将该菌的单克隆抗体与磁性纳米材料进行化学偶联构建磁性纳米探针,建立双抗夹心模式的检测试纸条,通过在层析体系中分别添加表面活性剂、盐离子、杂蛋白和糖类,探讨了其对层析的影响,减弱食品背景影响,提高了检测的准确性和灵敏度。张赛等[33]以抗单增李斯特菌单克隆抗体偶联磁珠制备免疫磁珠,示踪物为荧光胶乳微球,再利用免疫荧光检测仪检测荧光信号,荧光免疫层析试纸条对纯培养物的检测限为4×105CFU/mL,人工污染样品检测限为1×104CFU/mL,试验中未出现交叉反应。崔焕忠等[34]制备该菌的特异性单克隆抗体,研制胶体金试纸,对纯培养物检测的灵敏度为3.9×105CFU/mL。

3 生物传感器检测技术

生物传感器是一种将生物活性信号转换为电信号的装置,主要有准确度高、分析速度快等特点,但是有时需自行设计大型仪器,难度较大。Wang等[35]结合了免疫磁珠分离、尿素酶催化和电化学阻抗分析,设计了一种新的等效电路模拟生物传感器,该抗生物传感器在3 h内可检测到低至1.6×103CFU/mL的LM,适用于食源性病原菌的现场检测。Sharma等[36]使用基于磁性隧道结的高度灵敏的生物传感平台检测来自致病细菌的DNA,检测LM的DNA灵敏度低于nmol/L范围,具有很高的选择性和特异性。Zhang等[37]建立了基于纳米探针的生物传感器,用Fe3O4纳米粒子簇修饰的适配体作为信号放大纳米探针,特异性识别该菌的细胞壁,与单独的Fe3O4纳米颗粒相比,粒子簇对显色底物的显色反应表现出集体效应增强的催化活性,吸光度或颜色的变化可以代表目标的浓度,方法可在5.4×103～108CFU/mL的线性范围内直接测定。刘红平等[38]基于SnO2纳米粒子制备了LM特异检测半导体气体传感器,响应和恢复时间分别在11、16s以内,初始接种量约为10 CFU/mL的LM在牛奶中培养12 h后也能被检测出。Alhogail等[39]利用磁性纳米粒子开发了新型LM的比色纸基生物传感器,利用该菌产生的蛋白酶作为检测致病菌的生物标志物,检测限在30 s内为2.1×102CFU/mL,已经测试了传感器的特异性,效果较为理想。

4 光谱学检测技术

光学检测方法一般无需特别复杂的前处理,即可检测到其分布状态,该类检测方法一般有重复性较高、信号精度高等特点。基于振动光谱的检测技术,表面增强拉曼散射(SERS)光谱技术被认为是一种快速、可靠、高度敏感的细菌检测工具。Liu等[40]开发了一种SERS-LFD技术,再结合RPA检测LM,检测限为19 CFU/mL。Witkowska等[41]将SERS与主成分分析结合来检测和鉴定LM,检测和鉴定的整个过程(根据路径I)需要7 d;另外两条路径,检测过程分别简化为2和3 d,虽然只有48 h,但只有98%的准确性。Donoso等[42]开发了一种新型的纳米杂化化合物用于光学检测LM,可以观察到活性LM的荧光显微镜检测浓度为5.19×103CFU/mL,纳米杂合体对于该菌也是特异性的。Lu等[43]提出了一种新型便携式高度自动化的荧光检测仪器,该系统是由商用现成的光学元件构成的,用于收集光信号而自行设计的机械单元则作为驱动硬件的电源,该系统利用发光二极管激发荧光标记,光谱仪记录来自样品的荧光信号,能够在每次检测中最多自动测量十个样品,检测限在102～103CFU/mL。此类方法精度高,重复性好,但是所需检测仪器价格较贵,每次检测数量普遍有限。

5 其他检测技术

除了基于核酸检测、特有蛋白检测之外,还可以与色谱、核磁等多项技术技术相结合对LM进行检测。Sun等[44]开发了一种基于多重PCR与高效液相色谱法结合检测方法,用于高通量筛查食源性病原菌,对于纯培养物检测限为约10 CFU/mL,在污染的食品基质中少于102CFU/g,虽然需要昂贵的设备,但能在1 h内完成约400个PCR样品的信号检测且成本不超过10元。陶珊珊[45]偶联上LM的氧化锰纳米粒子能够特异性识别LM,并结合核磁共振技术,该方法检测的线性范围为10～103CFU/mL。范龙兴等[46]将磁分离技术、免疫分析技术和化学发光检测技术相结合,整个试验在37 ℃条件下进行,3～4 h即可完成检测,试验操作较为简便,检测限可达10 CFU/mL,交叉反应率极低。Zhao等[47]基于LM与抗体修饰纳米颗粒之间特异性结合所诱导的生物功能化磁性纳米颗粒的聚集,结合核磁共振技术开发了一种可靠的检测方法,官能化的Fe/Fe3O4纳米颗粒对其他干扰性细菌的存在具有高特异性,该方法的检测下限为3 MPN,检测上限为103CFU/mL,但是这种方法不适合检测可能含有LM的基质高于103CFU/mL,整个检测时间在40 min内完成,总成本低于250元/样。一些正在开发的生物传感器或纳米传感器技术可在几个小时内完成病原菌的快速检测,这是一个新兴的研发领域,快速、准确、便携也是未来检测技术的发展方向[48-50]。

6 结论

如今RTE种类越来越丰富,人们需求量也逐渐增大,因此为保证食品安全,研究人员对食源性致病菌的检测显得尤为重要。已有学者研发出不同的检测技术,有的将几种技术相结合来提高效率,有利于控制病原菌的传播与污染。新兴的生物识别转导技术提供了开发小型、快速、无线传感器的新思路,可用于增加病原菌监测的分辨率来确保食品的安全性,期待这些技术的应用日趋成熟,以满足监管机构和消费者对食品质量与安全的要求。