肺泡灌洗液在肺癌早期诊断方面的研究进展

杨敬平 杨俊俊 周 婵 刘 娜 徐兴祥

肺癌是全球癌症相关死亡的最常见原因。每年约有180万人被诊断出患有肺癌，其中约有160 万人死于肺癌［1］。然而在我国约75%的肺癌患者在确诊时已属晚期，5 年生存率仅为15.6%［2］，有研究表明对于Ⅰ期非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）患者早期手术切除，其5 年生存率可提高至70%～90%［3］。这表明早期诊断和早期治疗在提高肺癌患者生存率、降低死亡率中起着至关重要的作用。目前世界范围公认的早期肺癌筛查手段为低剂量CT（low-dose computed tomographic，LDCT），美国国家肺癌筛查试验（National Lung Screening Trial，NLST）的随机对照研究结果显示LDCT 筛查可使得肺癌死亡率相对降低20.0%，但其假阳性率高达96%［4］，而对于其分辨率无法识别的早期肺癌又易漏诊，因此对于肺癌的筛查迫切需要一种创伤小、敏感性高、特异性好的标志物。肺癌是起源于支气管黏膜上皮及肺泡上皮的恶性肿瘤，脱落的肿瘤细胞及其代谢产物可直接进入肺泡腔内，所以支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）较其他液体标本更好的显示其中组分特异性，肺泡灌洗液中细胞学、分子生物学都可用于肺癌的早期诊断，本文就BALF 中DNA 甲基化、外泌体、端粒酶、非整倍体等在肺癌早期诊断方面的研究作一综述。

一、DNA 甲基化

DNA 甲基化是表观遗传学的一个重要研究领域，DNA甲基化参与了个体发育和细胞分化等基本生物学过程。在人类多种恶性肿瘤中均发现有DNA 甲基化异常，包括基因启动子区域的高甲基化和全基因组低甲基化［5］。有研究表明抑癌基因启动子区域高甲基化导致抑癌基因失活，是肺癌发生的早期事件［6］。有研究表明RASSF1A、APC、ESR1、ABCB1、MT1G 和HOXC9 的启动子甲基化与早期肺癌有关［7］，随着人们对液体活检的关注及甲基化特异性PCR 为代表的甲基化检测技术的发展，研究者相继发现了BALF 在肺癌早诊断筛查中的价值。 一项研究发现SHOX2 和RASSF1A 的甲基化对肺癌的诊断效率比细胞学检查、血清生物标志物癌胚抗原要高［8］，SHOX2 和RASSF1A 甲基化联合对肺癌的诊断灵敏度为81.0%，特异性为97.4%，并发现SHOX2 和RASSF1A 甲基化在Ⅰ期肺癌患者中检出率最高，为85.7%，高于晚期肺癌患者。一项Meta 分析显示BALF 中P16 基因启动子甲基化在NSCLC 诊断方面具有较好的特异性及的敏感性［9］，分别为0.61，特异性为0.81，有望成为NSCLC 微创诊断方法。Lei Tuo 等［10］的Meta 分析显示BALF中P16 INK4a 基因启动子甲基化检测可能是NSCLC 诊断的潜在生物标志物，但敏感性较低，不适合NSCLC 筛查。现有研究表明肺泡灌洗液中SHOX2 和RASSF1A 的甲基化联合诊断对肺癌的早期诊断具有较好特异性及灵敏度，P16 基因启动子也对肺癌具有较好的诊断价值，但在上诉三者联合诊断的价值方面尚缺乏相关研究及文献支持。

二、外泌体

外泌体是源于细胞“内吞-融合-外排”等调控过程而形成的胞外纳米级多泡体（multivesicular bodies，MVBs），其含有蛋白质、脂质、核酸等多种活性成分［11］。外泌体可以由许多类型细胞释放，如网织红细胞，树突细胞，淋巴细胞和癌细胞［12］。外泌体可从许多体液中净化，如血液，尿液，胸腔积液，腹水和支气管肺泡灌洗液［13］。肿瘤中外泌体含量比正常细胞多，高达正常细胞的3 倍［14］，且外泌体被高度稳定的脂质双层膜保护而不被降解［15］。因此，所有这些特征都使外泌体具有成为早期肺癌诊断的潜在标志物的优势。有研究表明，从NSCLC 患者的循环中外泌体分离出miRNA 与NSCLC 组织中miRNA 表达的模式具有一致性［16］，提示外泌体miRNA 可作为非小细胞肺癌的液体活检材料。一些研究人员开发了肿瘤相关外泌体和非肿瘤外泌体表面组成差异的方法检测，从而利于肿瘤外泌体的检出，增加了外泌体检测的特异性［17］。Jin 等［18］使用let-7b-5p、let-7e-5p、miR-23a-3p 和miR-486-5p 四标记板检测NSCLS 患者血液外泌体，得出他们对Ⅰ期NSCLC 的鉴别诊断表现出了良好的诊断前景，AUC 为0.899，敏感性为80.25%，特异性为92.31%。目前有研究表明血标本中外泌体在肺癌早期诊断方面存在一定意义。因为肺癌起源于支气管和肺泡，因此气道中的标志物比外周血的变化更早、更高［19］。但目前对BALF 中外泌体的研究较少，可能与BALF 中外泌体的收集、分离过程、检测方法等有关，由于标本的收集、处理和储存过程影响外泌体的浓度、组成和功能，从而对接下来的分析产生重大影响［20］。随着外泌体相关技术的发展，将来BALF 中外泌体对肺癌早期诊断的价值有望被发现。

三、端粒酶

端粒酶是延长染色体末端重复DNA 序列长度的逆转录酶［21］。在大多数正常细胞中，端粒酶的表达受到严格抑制，导致端粒随着细胞的每一次分裂而逐渐缩短。相比之下，端粒酶活性在90%以上的人类癌细胞中显著上调或激活［22］，如肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和尿路上皮癌等，提示端粒酶在使细胞成为永生细胞中发挥着重要作用［23］。正常细胞和癌细胞端粒酶活性的差异使端粒酶成为一种潜在的癌症诊断生物标志物。有研究证实肺癌与端粒酶活性存在相关性［22］。Dikmen 等［24］通过检测肺癌患者BALF 中端粒酶活性，得到其敏感性和特异性分别为72.7%和85.7%，细胞学检查结合端粒酶活性的敏感性（81.8%）明显高于单纯细胞学检查（54.5%），得出细胞学检查联合端粒酶检测可提高其对肺癌诊断的准确性。有研究表明BALF 中端粒酶活性测定有利于肺外周孤立性结节的定性诊断［25］，敏感性为68.5%，特异性为93.2%。目前单分子生物物理学工具包已经足够成熟，许多研究人员已经开始开发直接探测端粒和端粒酶的动态和异质性的分析方法，使得早期监测异常端粒酶活性成为可能［26］。因此端粒酶活性的检测将更好的辅助肺癌的早期诊断。

四、非整倍体

非整倍体是指个别染色体减少或增加一条或几条而导致染色体数目非整倍数，是细胞分裂时染色体分离异常、丢失、易位等的结果［27］。非整倍体可见于90%的实体瘤和50%的血液肿瘤［28］。染色体不稳定性是癌症发生的一个主要特征，其通常导致非整倍体的形成［29］，因此非整倍体与早期癌症存在相关性，可用于早期诊断。有研究表明细胞DNA定量分析方法检测非整倍体与液基细胞学（liquid based cytology，LBC）联合检查能提高肺癌的阳性检出率［30］。一项研究表明在细胞学阴性细胞中，间期核荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）能发现标志着恶性肿瘤存在的异倍体［31］，所以可能有助于诊断癌前病变及肺癌早期诊断。临床样品中非整倍性的检测对于癌症中的各种诊断应用很关键，通过扩增长散在核苷酸元件（LINEs）方法可应用于仅含有少量纳克DNA 和少至1%的肿瘤含量的样品［32］。有研究表明如果非整倍体伴随有P53 突变、纺锤体组装检查位点（spindle assembly checkpoint，SAC）则证明是肿瘤非整倍体［27］，所以随着检测技术的发展，将上述指标联合检测将为肺癌早期筛查提供更准确的诊断。

随着LDCT 在肺癌筛查中的应用及影像技术、影像基因组学的发展，大多数肺部疾病患者被检出肺结节，提高了早期肺癌确诊率，但仍有部分早期肺癌无法确诊，所以需要分子生物学、细胞学等的补充，从而有助于预测肺结节性质、优化治疗效果、防止过度诊疗或治疗不足。研究表明支气管肺泡灌洗液作为肺癌早期筛查和诊断有很好的前景，但还有许多问题需要克服：①BALF 中分子标志物作为肺癌的新兴标志物，其在肺癌发生发展演化过程中的具体机制尚未完全清楚，单个指标的敏感性及特异性不高，这就需要我们寻找最佳的分子组合或联合其他诊断方法，从而为肺癌的早期诊断提供全面有效的手段；②由于BALF 中各种指标的检测方式不一样，所以需要收集BALF 的量、保存条件、分离方法等有所不同，目前受标志物检测技术的限制和高成本，也成为其广泛应用的一个障碍；③分子标志物的研究尚缺乏大样本实验验证其有效性。总之，BALF 中分子标志物具有肺癌早期筛查的潜质，上述问题将是我们未来研究的重点及需要攻克的难关。