肿瘤突变负荷检测及临床应用中国专家共识（2020年版）

中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会遗传性肿瘤标志物协作组，中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会分子病理协作组

以免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）为主的免疫治疗显著提高了晚期恶性肿瘤患者的客观缓解率（objective mitigation rate，ORR）和总生存期（overall survival，OS），然而整体单药有效率不足20%，且费用普遍较高，也常伴随不同程度的免疫相关不良反应。因此，亟需寻找准确可靠的生物标志物筛选免疫治疗的潜在获益患者。以肿瘤基因变异数目为特征的肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）显示出与ICIs疗效的相关性，但在临床研究和实践过程中TMB评估尚缺乏统一标准。为促进TMB检测和临床应用的统一认识及检测规范化，中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会分子病理协作组和肿瘤标志专业委员会遗传性肿瘤标志物协作组组织相关专家，综合国内外TMB检测和临床应用共识推荐、重要文献及临床实践，编写本专家共识，对TMB检测的临床意义、检测过程中样本类型、检测方法、包含基因、生物信息学分析方法以及参考值设定等给出指导性建议，并对肿瘤免疫治疗过程中包括TMB在内的不同疗效预测生物标志物选择给出专家组意见，以期最大可能提高ICIs治疗疗效预测的准确性和可靠性。

1 TMB的定义

TMB一般指特定基因组区域内每兆碱基对（Mb）体细胞非同义突变的个数，可以间接反映肿瘤产生新抗原的能力和程度，已被证实可预测多种肿瘤的免疫治疗疗效［1-2］。肿瘤特异性突变基因可产生新的蛋白，这些蛋白或其降解产物被主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）递呈至肿瘤细胞表面形成肿瘤新抗原，然后被活化的CD8+T细胞识别，从而触发靶向肿瘤的免疫反应，因此肿瘤基因突变被认为是抗肿瘤免疫治疗的前提［3］。ICIs如PD-1抗体、PD-L1抗体和CTLA-4抗体等可通过拮抗T细胞活化的抑制分子，促进T细胞对肿瘤识别，从而恢复抗肿瘤免疫反应［4］。近年来，越来越多的数据证实TMB越高的肿瘤新抗原负荷越高，更有可能从ICIs治疗中获益［5］。在一定程度上，TMB水平反映的是肿瘤细胞内DNA的修复损伤情况，与产生肿瘤新抗原能力密切相关。DNA错配修复基因（mismatch repair genes，MMR）负责修正DNA复制错误，若MMR存在突变往往会导致微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI），因此高微卫星不稳定（MSI high，MSI-H）常作为MMR功能缺陷（mismatch repair deficient，dMMR）的替代指标［6］。此外，DNA 聚合酶 ε（DNA polymerase ε，POLE）和 DNA 聚合酶 δ1（polymerase delta 1,POLD1）对 DNA复制的校对和保真至关重要，POLE/POLD1基因突变（特别是外切酶活性域突变）也会导致肿瘤的高突变或超突变（TMB>100个突变/Mb）［7］。在 TMB实际检测中，多种因素会影响其评估流程、实验结果及其解释，如样本类型、样本质量和数量、基因组覆盖率、测序平台、生物信息分析流程以及阈值设定等［5］。此外，不同器官来源和组织类型的肿瘤TMB数目和类型也存在显著差异［8］。因此，明确TMB的使用前提和范围对临床正确应用TMB作为肿瘤免疫治疗疗效预测生物标志物尤为重要。

专家共识：TMB一般是指特定区域内体细胞非同义突变的个数，通常用每兆碱基有多少个突变表示（XX个突变/Mb）。TMB评估受样本质量和数量、检测基因组大小、生信分析方法等多种因素影响，临床应用前应了解TMB的适用范围。不同检测方法获得的TMB应进行系统评估,判断是否具有可比性。TMB数值可反映肿瘤内产生肿瘤新抗原的潜力，与DNA修复缺陷密切相关，在多种肿瘤中dMMR和MSI-H患者具有较高的TMB。

2 TMB的临床意义

2.1 组织TMB可作为免疫治疗独立的疗效预测生物标志物

2014年，TMB首次被证实与CTLA-4抗体治疗恶性黑色素瘤疗效存在相关性［9］。2015年发现组织TMB（tTMB）与非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者接受 PD-1 抗体治疗效果相关［10］。CheckMate 026、027、012 研究发现，TMB 或 PD-L1可独立预测晚期NSCLC的ICIs疗效，且与仅表现为高TMB或PD-L1高表达患者相比，同时具有高TMB和高PD-L1表达的患者无进展生存期（progression free survival，PFS）更长，说明TMB单独或联合检测均具有较好的疗效预测效能［11-12］。基于CheckMate 227、568、032 研究数据［12-14］，2018 年发布的 NCCN NSCLC临床实践指南（2019.v1）首次将tTMB作为免疫治疗疗效预测标志物，为NSCLC患者接受免疫治疗提供参考依据。后续在尿路上皮癌、小细胞肺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结直肠癌等更多研究中也发现高tTMB与免疫治疗效果存在相关性［15-16］。

2017年一项荟萃分析发现tTMB对27种肿瘤的免疫治疗有显著的疗效预测作用，tTMB与ORR存在显著相关性（P<0.001），提示tTMB与PD-1/PDL1抗体疗效存在强相关性，这一结论为其泛癌种治疗探索奠定了基础［17］。2019年纪念斯隆凯瑟琳癌症研究中心发表的研究采用MSK-IMPACT二代测序分析1 662例接受ICIs治疗共包含10种晚期癌症患者，结果显示较高的tTMB与更好的OS相关；且在大多数患者中，tTMB越高对ICIs的应答反应越好［18］。这项研究也是迄今为止规模最大、最全面的关于tTMB预测肿瘤免疫治疗疗效的研究，为tTMB作为潜在的泛癌种生物标志物提供了有力证据。2020年6月，FDA批准Pembrolizumab单药用于治疗不可切除或转移性的高tTMB（TMB-H≥10个突变/Mb）成人及儿童实体瘤患者（既往治疗后疾病进展且没有更好的替代疗法），其中Foundation One CDx为共同获批的伴随诊断检测方法［19］。虽然tTMB作为ICIs疗效预测标志物尚存争议，但日益受重视［20］，已成为继MSI-H/dMMR后的第二个肿瘤免疫治疗泛癌种伴随诊断标志物。

专家共识：tTMB是一个新兴的独立ICIs治疗疗效预测标志物，与多种肿瘤类型ICIs单药或两种ICIs联合治疗的疗效相关，已证实可作为泛癌种免疫治疗疗效的预测标志物。推荐既往标准治疗后疾病进展且没有更好替代疗法的实体瘤患者，尤其是高TMB的患者进行TMB检测，有助于扩大免疫治疗获益人群。中国人群 TMB的独立预测价值仍需更多前瞻性研究验证。

2.2 血液TMB与tTMB具有显著相关性

随着液体活检技术的发展，组织标本获取困难的患者通过评估血液TMB（bTMB）预测免疫治疗疗效和动态监测治疗变化成为可能。一项回顾性研究［21］分析超过 1 000份接受 Atezolizumab治疗的NSCLC患者治疗前的bTMB，发现bTMB≥16个突变/Mb的患者接受Atezolizumab治疗可获得更长的PFS；联合PD-L1表达分析可更好地筛选从Atezolizumab治疗中获得更长PFS和OS的患者。该研究还发现bTMB与tTMB具有相关性，但检出的突变大部分不一致，且组织与血液样本收集时间间隔越大异质性越高。有研究［22］发现，bTMB≥20个突变/Mb的患者Durvalumab单药或联合曲妥珠单抗均较传统化疗具有更好的ORR、PFS和OS。另一项基于中国人群的回顾性研究［23］也发现，bTMB≥6个突变/Mb的NSCLC患者PFS和ORR较bTMB<6个突变/Mb患者显著改善（mPFS：NR vs 2.9 m；ORR：39.3%vs 9.1%），治疗应答组的bTMB水平也显著高于未应答组，且NCC-CGP150与采用全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）检测的组织 TMB 有相关性（r=0.91）。一项基于bTMB对NSCLC患者进行分层管理的前瞻性B-F1RST研究［24］显示，bTMB≥16个突变/Mb的患者单药Atezolizumab治疗ORR更优，PFS亦呈获益趋势，但OS尚未知，有待数据更新。

专家共识：目前研究证据显示在NSCLC中bTMB与tTMB具有显著相关性，但bTMB检测无统一标准。多项回顾性研究发现高bTMB与NSCLC患者接受单药ICIs治疗获益显著相关，但尚未获得高级别前瞻性临床研究证实。

3 TMB检测的标准化

3.1 样本收集、处理原则

目前临床实践中以tTMB检测最为常见，大多数研究认为bTMB检测准确性有待进一步验证［25］，故本共识依据国内已经发布的NGS检测指南及共识意见［26-27］，重点规范tTMB的样本收集和处理原则。

3.1.1 tTMB检测标本类型和推荐要求 ⑴福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织：建议送检近期蜡块（原则上不超过3年，1年内较好）或6～8周以内的石蜡切片，切片厚度4～5 μm；手术样本（较大样本）≥5张；穿刺样本或小标本至少10张以上。要求肿瘤细胞数能够满足检测和质控要求，如果肿瘤细胞不足，患者知情后仍愿意进行tTMB检测，必要时可采用显微切割等方法对肿瘤细胞进行富集或去除坏死细胞，以提高tTMB检测敏感性。⑵新鲜肿瘤组织（因评估肿瘤细胞比例困难，不推荐作为常规检测标本类型）：手术样本（较大样本）≥10 mg（米粒大小），穿刺样本或小标本至少为肉眼可见的1条以上肿瘤组织。tTMB检测与计算受肿瘤细胞占比影响，FDA批准的tTMB检测产品对肿瘤纯度要求均≥20%。⑶正常对照：大部分TMB检测需要正常对照，为检测提供胚系变异信息。可采用全血标本、唾液或石蜡包埋正常组织。全血标本：若用全血样本作为对照，以2～5 mL EDTA抗凝外周血，轻微颠倒混匀8～10次，避免凝固，常温运送至检测实验室，并在2 h内处理，注意防止溶血现象。如不能在2 h内处理或需要长途运输，建议用游离DNA专用采血管常温保存或运输。⑷病灶选取：肿瘤原发灶与远处转移灶组织均可用于tTMB评估。

有研究在肺腺癌配对的原发灶、远处转移灶和淋巴结转移灶进行tTMB检测，发现淋巴结tTMB显著低于原发灶，但远处转移灶与原发灶差异并不明显；同一瘤灶不同部位也可能存在明显的瘤内基因突变异质性，致使tTMB值存在较大差异［5］。目前尚未见TMB样本异质性与相应临床疗效的相关研究。

3.1.2 核酸提取与质控 建议优先采用国家药品监督管理局（national medical products administration，NMPA）批准上市的核酸提取试剂盒，并在满足高通量测序要求的实验室内完成核酸提取。tTMB检测前需评估核酸纯度、浓度和核酸片段化程度。肿瘤组织DNA文库质量至关重要，当浓度低于5 nmol/L时，tTMB值会虚高而出现假阳性。临床基因检测实验室可以选择合适的平台对核酸进行质控。核酸浓度建议采用微量核酸荧光定量计测定，片段化程度建议采用琼脂糖凝胶电泳或核酸生物分析仪等方法评估。基于大Panel基因检测完成的tTMB所需核酸样本量，根据测序方法不同所需核酸量为20～200 ng不等，其中基于WES检测的tTMB所需的核酸量建议不少于 250 ng［5，28］。

专家共识：推荐使用近期石蜡包埋肿瘤组织样本进行tTMB检测，待检测组织应首先完成病理质控并确保恶性肿瘤细胞数能够满足检测要求。为过滤胚系突变对后续tTMB评估的影响，应采集患者外周血、唾液或正常组织作为对照样本。建议优先采用NMPA批准上市的核酸提取试剂盒进行基因组DNA提取，tTMB检测实验室应根据实际需求建立合适的DNA样品质控标准和操作流程，对待测DNA样品纯度、浓度及片段化程度进行严格质控。肿瘤原发灶与远处转移灶组织均可用于tTMB评估。

3.2 TMB检测的Panel设计和平台选择

3.2.1 TMB检测的Panel选择 WES是进行TMB检测的“金标准”，多项研究发现采用WES所得的TMB与免疫治疗临床获益相关［29-30］。WES覆盖了编码区大概2.2万个基因（约18万个外显子，30 Mb），占整个基因组的1%，其中包括大多数已知致病突变［31］。然而，WES成本较高、样本需求量较大、数据分析较复杂，因此在临床应用中受限［2,32-34］。靶向测序Panel聚焦于大量肿瘤相关基因，可以结合生物信息学算法快速高效检测肿瘤靶基因组改变［35-36］。因此，采用靶向测序Panel进行肿瘤基因组分析已成为WES在临床检测的另一种选择。目前已有1款WES检测产品和3款靶向测序Panel获FDA批准，其中靶向测序Panel通过计算机模拟及临床实践证实与WES具有较好一致性［2，36-39］。

3.2.2 TMB检测的Panel大小 靶向测序Panel大小是影响TMB评估值置信区间、阈值、检测灵敏度、特异度及阴性和阳性预测值的重要参数［40］。不同测序Panel检测基因组区域的大小不同，所得TMB值也不同。Dana-Farber癌症研究所通过建立大（300个基因）、中（48个基因）、小（15个基因）Panel模型，发现小Panel模型仅足以检测高突变负荷和超高突变负荷肿瘤，而大Panel模型检测的数据相对更准确［41］。多个研究机构也通过建立随机突变模型，对真实世界癌症基因组的非随机突变及来自公共数据库的瘤内异质性进行模拟，发现靶向测序Panel评估的 TMB（Panel sequencing TMB，psTMB）变异系数（coefficient of variation，CV），与 Panel大小的平方根及TMB水平的平方根成反比，其中当肿瘤TMB阈值为10个突变/Mb时，随着Panel覆盖范围减小（4、2、1、0.5和 0.25 Mb），CV 不断上升（22%、26%、32%、45%和 63%）；当 Panel＜0.5 Mb时，CV急剧升高，但Panel＜1.0 Mb时评估TMB的准确性显著降低，不能有效区分免疫治疗获益人群［42-45］。美国癌症研究协会（American Association for Cancer Research，AACR）发起的肿瘤基因组学证据信息交换研究（Genomics Evidence Neoplasia Information Exchange，GENIE），对来自8个研究中心约19 000例肿瘤患者的真实TMB数据的研究也得出相似结论：TMB介于0～5个突变/Mb时，约三分之二的样本无法通过小Panel准确评估，Panel覆盖范围＞1 Mb才可准确评估TMB［46］。全方位癌症基因分析开展的万人TMB检测结果及纪念斯隆凯瑟琳癌症研究中心进行的靶向测序Panel评估TMB结果均表明，对几百个基因进行靶向测序可以有效识别TMB-H肿瘤，而高于几百个基因的靶向测序Panel准确率并不会显著提高［2，47］。因此，建议评估 TMB 的靶向测序 Panel理想覆盖范围介于1.5～3.0 Mb［42］。通过分析FDA批准的3款靶向测序Panel，发现评估TMB的靶向测序Panel也覆盖范围≥0.8 Mb时能满足临床需求［36,38-39］。此外，靶向测序Panel也可能因覆盖的基因组区域不同而引起不必要的偏倚。为了分析所选基因对psTMB CV的影响，德国、英国及瑞士多个研究机构模拟了以下3种不同Panel：⑴专由癌基因和抑癌基因组成的Panel A；⑵随机选择的基因Panel B；⑶排除癌基因和抑癌基因后随机选择的基因Panel C。结果发现，Panel B和Panel C评估TCGA数据库的TMB方差较评估随机突变模型的TMB方差增加了6%，而Panel A增加了15%，提示Panel设计应尽量避免只选择原癌基因和抑癌基因［40］。总之，TMB检测的Panel应尽可能包含患者更多的分子遗传信息，基线也要同步进行其他相关驱动基因检测，如可指导靶向治疗的驱动基因突变（EGFR、ALK、ROS1、RET、NTRK、BRAF、ERBB2、KRAS 和 MET 等），与基因变异产生相关的免疫治疗正向预测因子（dMMR/MSI、POLE、POLD1和 BRCA1/2等）以及可能的免疫治疗负向预测因子（β2M、PIK3CA、JAK1/2、PTEN和STK11/LKB1等），尽可能避免重新活检及基因检测而导致治疗时机延误［7,33,44,48-49］。

3.2.3 测序覆盖深度 WES的标准测序深度只达到100×才能使检出的等位基因突变频率＞15%，TMB评估结果才可信。如果采用靶向测序Panel，测序深度至少应＞500×，才能增加在特定位点检测低频变异的可能性［40，50］。韩国研究者发现石蜡包埋样本中检测突变频率≥10%时，所需的最小测序深度为200×［51］。FDA 批准的 MSK-IMPACT 测序 Panel平均覆盖深度达200×。2019年欧洲肿瘤内科学会（European Society for Medical Oncology，ESMO）推荐精确评估 TMB所需最小覆盖深度＞200×［5,28］。

3.2.4 测序平台的选择 目前主流的NGS测序平台有illumina、Thermofisher和华大基因测序平台。不同实验室可以依据样本量、时效要求选择不同测序平台［36,38,40］。

专家共识：采用靶向测序Panel进行TMB评估时，建议与WES评估的TMB进行一致性评价。靶向测序Panel覆盖范围原则上不应＜1.0 Mb，最低有效测序深度应≥500×。建议进行TMB检测的靶向测序Panel尽可能涵盖患者更多的其他分子遗传信息，包括可指导靶向治疗的驱动基因突变、与基因变异产生相关的免疫治疗正向预测因子以及可能的免疫治疗负向预测因子。目前已有多款NGS测序仪获国家NMPA批准用于临床基因检测，不同实验室可依据样本量、时效要求选择不同测序平台。

3.3 TMB算法的标准化要求

TMB算法的核心要素是对能影响蛋白质编码的体细胞突变的探测及计算。为确保TMB计算结果的准确性，应从算法角度注意测序数据以及突变分析中可能出现的各类问题。

3.3.1 测序数据质控 从测序平台产生的原始数据到体细胞突变的检出，通常经过质控、数据过滤、基因组比对和突变检出四个过程。原始数据通常存在低质量读长（reads）、接头污染和插入删除错误等，一定程度上影响后了续分析过程。因此，下机数据必须经过严格的质量评估，制定有效的质控标准，包括数据有效率＞99%、错误率＜0.1、Q20＞90%、Q30＞85%、GC含量42%～55%、比对率＞95%、目标区域平均测序深度、均一性和链偏移等评价参数。

3.3.2 TMB算法与突变分析 原始测序数据过滤后需要用各种生物信息分析工具进行基因组序列比对和突变检出。目前NGS比对常用的软件有BWA、Bowtie、SOAP、BFAST、ELAND、MAQ 和 SHRiMP等，其中采用基于人参考基因组比对的SMEM算法BWA软件最常用。突变检出的常见算法有基于统计学方法的Variant caller、VarScan2和基于贝叶斯模型的Strelka、Mutect2等。基于人工智能的加速算法GVC（genomic variant caller）可通过人工智能模型拟合各个平台数据，数据结果高效准确，且检测速度是常规软件的4～8倍，加快了NGS在临床转化中的应用进程。

3.3.3 TMB算法准确性评估 以数百个基因的肿瘤靶向Panel检测是通过计算覆盖在产品外显子上的体细胞突变数目除以产品的外显子覆盖区域得到基于Panel的TMB结果，然而其计算得到的TMB值与WES检测得到的TMB值存在偏差［16,52-54］。在计算TMB值时还应考虑肿瘤纯度带来的偏差。ANAGNOSTOU等［55］发现随着肿瘤纯度降低，体细胞突变位点频率也随之降低，经过肿瘤纯度校正参数校正的TMB值能更好地区分接受ICIs治疗患者的疗效，当肿瘤纯度较低时，需要较大的肿瘤纯度校正参数，原则上要求细胞纯度不低于25%。

目前的检测方法中，可依靠或不依靠对照样本（外周血或癌旁组织）去除遗传性突变。美国FDA批准的 4个检测肿瘤 TMB方法中，MSK-Impact、Omics Core及PGDx elio tissue complete是通过检测患者白细胞对照过滤肿瘤样本中检测到的遗传性突变，以确保用于计算TMB的突变均为体细胞突变。Foundation One CDx以及获得FDA突破性器械待遇的TruSight Oncology 500只检测癌组织，不对正常组织或白细胞进行测序，以去除测序数据中的遗传突变。其中，Foundation One CDx通过人群数据库过滤和 SGZ（somatic-germline-zygosity）算法确定体细胞突变［56］。SGZ算法通过对每个突变位点的突变频率进行建模，同时考虑肿瘤细胞含量、肿瘤细胞多倍体状态和局部拷贝数变异，预测准确性取决于序列测序深度的拷贝数模型拟合。但由于目前公开的人群数据库均以欧美人群为主，不适用于中国人群TMB检测，因此建议TMB的体细胞突变确定应使用对照样本（外周血或癌旁组织）去除患者的胚系变异，或使用中国人群大样本遗传性突变数据库构建背景库过滤胚系变异。

专家共识：基于靶向测序Panel的TMB检测应以WES检测为金标准，纳入影响蛋白质编码的体细胞突变，应保证检出突变频率≥5%的体细胞突变，以保证TMB检测值的准确性和稳定性；应依托ICIs疗效随访数据库对基因组比对和突变检出算法开展标准化研究；Panel检测区域可影响TMB值，应通过至少1 000例WES数据予以校正。同时建议使用对照样本过滤胚系变异。

3.4 TMB阈值的探索与临床应用

3.4.1 TMB在不同癌种间的分布情况 基于TCGA数据库的27种肿瘤类型WES分析结果显示，不同肿瘤类型的中位非同义突变频率差异超过1 000倍。儿童肿瘤的TMB最低约为0.1个突变/Mb，而部分恶性黑色素瘤和NSCLC患者的TMB超过了100个突变/Mb。且同癌种不同患者的TMB值也存在高度异质性，如恶性黑色素瘤和肺癌中，不同患者的TMB值介于 0.1～100个突变/Mb［57］。一项基于10 000例的泛癌种队列DNA靶向测序研究也显示类似结果［37］。

3.4.2 TMB阈值的确定策略 TMB的中位值和分布范围在不同癌种中有所不同，其中TMB较高的肿瘤类型，统一阈值可筛选出较多TMB-H患者；相反，在TMB整体较低的癌种中，统一阈值则会筛选出较少的TMB-H患者。因此，在各个癌种中应使用相同的筛选策略，即选择排序在20%以上的病例定义为TMB-H组。但是筛选出的TMB-H阈值在不同癌种中还是显示了巨大差异，介于4.4～52.2个突变/Mb［18］。因此在不同癌种中分别制定适宜的TMB-H阈值尤为必要。

3.4.3 TMB阈值的临床效能验证 BUDCZIES等［43］以TCGA数据库中WES TMB结果为金标准，以WES TMB=199个突变/Mb为临界值，与之匹配的Panel为基础的TMB阈值肺腺癌为10%～12%，肺鳞癌为17%～19%。FIR、BIRCH和POPLAR系列回顾性研究首次采用基于基因组DNA靶向测序的Foundation One LDT方法，分别以9.9个突变/Mb或>75%群体为阈值，均能在一定程度上区分ICIs治疗获益人群［58］。而CheckMate 568和CheckMate 227两个前瞻性Ⅲ期临床研究用经过平行验证的Foundation One CDx方法，发现10个突变/Mb为NSCLC接受免疫治疗的最佳疗效预测TMB阈值［59］。因此认为，ICIs临床疗效才是确定TMB阈值的最佳评价标准。

专家共识：TMB值在不同癌种中存在显著差异，应依据ICIs临床疗效确定阈值，才能最大可能筛选出ICIs治疗的潜在获益人群。值得注意的是，不同靶向测序Panel的TMB检测体系之间TMB阈值不能通用。

3.5 TMB报告模板的初步建议

3.5.1 TMB报告应包含的内容 ⑴基本信息：①受检者信息，包括姓名、性别、年龄、临床诊断、病理诊断、基因检测史、家族史和临床治疗史等；②样本信息，包括样本类型、样本采集时间、送检机构和送检日期等；③项目简介，包括检测方法、检测平台、检测内容（包括基因数量、Panel大小等）、文库构建和参考基因组等。⑵检测结果：体细胞编码突变总数、TMB值、肿瘤类型、TCGA数据库排序和结果释义等。⑶检测结果解读：①TMB评估，包括突变类型、最低检出频率及与WES对比一致性等；②结果解读，包括是否有明确的阈值说明，不同癌种、不同免疫治疗方案应列明不同阈值与用药相关性的临床试验证据支持。⑷签字：检测技术人员及审核人员签字，最终报告应由中级职称或硕士以上学历且具有病理学背景、经培训合格的本单位执业医师或授权签字人（高级职称或医学博士学位）审核。⑸局限性说明：根据肿瘤类型、受检样本类型、检测Panel以及相关临床研究结果等信息对TMB临床应用的局限性进行说明。

3.5.2 TMB报告临床解读建议 SAMSTEIN等［18］证实不同癌种接受免疫治疗获益的TMB阈值不同。在Atezolizumab用于治疗膀胱癌的临床试验IMvigor210中，用Foundation One产品检测的TMB阈值≥16个突变/Mb［60］。而在治疗NSCLC的临床试验BIRCH/FIR中，Foundation One产品检测一线患者的TMB阈值≥13.5个突变/Mb，二线≥17.1 个突变/Mb［58］。POPLAR临床试验的TMB阈值≥15.8个突变/Mb［5］。在Nivolumab联合Ipilimumab治疗NSCLC患者的CheckMate 012研究［11］、小细胞肺癌患者的 CheckMate 032 研究［61］及恶性黑色素瘤患者的CheckMate 038研究［62］中，用WES检测TMB阈值分别为≥307个突变/Mb、≥248个突变/Mb和≥100个突变/Mb。由此可见，TMB作为ICIs疗效预测的生物标志物，不同药物伴随诊断产品的TMB阈值参考价值相对有限，用统一的TMB阈值判断患者对不同ICIs的疗效不妥。

专家共识：TMB报告内容除重点描述TMB计算原则和数值外，还应针对癌种的免疫治疗意义进行解读；同时还需系统评估Panel检测的各种驱动基因突变情况，以全面解患者的肿瘤生物学特征，建议应用分子肿瘤诊治专家组模式（MTB）进行临床辅助决策。

4 TMB联合应用展望

作为一个新兴的ICIs治疗疗效预测标志物，TMB在临床应用中还处于初始阶段，检测技术还在不断完善，临床意义也在不断丰富。最近有研究发现，TMB与其他肿瘤免疫治疗相关标志物（如PD-L1、MSI）联合应用，或能提高免疫治疗疗效预测的准确性和精确性，但具体的联合策略还需要进一步探索。

4.1 TMB与PD-L1

PD-L1是最早发现可以预测ICIs疗效的生物标志物，但肿瘤内PD-L1具有异质性和表达不稳定性，且仍有约20%的PD-L1阴性患者可从PD-1/PD-L1抗体治疗中获益［63］，因此PD-L1作为ICIs疗效预测生物标志物应用相对有限。临床实践证实，多种基因突变水平高的肿瘤如恶性黑色素瘤、膀胱癌、NSCLC等经PD-L1抗体治疗均获得良好效果。然而，仅有部分患者同时表现为TMB-H和PD-L1表达阳性。但TMB-H人群中无论是否表达PD-L1，免疫治疗疗效一般优于化疗；且相对于单一TMB-H或PD-L1阳性，TMB-H且PD-L1表达阳性的患者免疫治疗疗效更优［47］。

4.2 TMB与MSI

作为基因组不稳定性的重要标志物，MSI-H/dMMR通常也伴随TMB-H。MSI-H肿瘤样本中有超过80%表现为TMB-H，且有97%的样本TMB≥10个突变/Mb［2］，存在DNA损伤修复基因突变的患者也较无突变患者获得更好的免疫治疗应答［64］。然而，dMMR/MSI-H阳性比例在不同癌种间存在显著差异，此外虽绝大多数dMMR/MSI-H患者具有较高的TMB，但仍有部分TMB-H患者表现为 MSS［65］，因此单独检测dMMR/MSI-H可能使部分TMB-H患者失去治疗机会。还有研究报道，在不同类型的肿瘤组织中TMB、MSI和PD-L1同时阳性的概率只有0.6%［6］。

4.3 TMB与总新抗原负荷

总新抗原负荷（total neoantigen burden，TNB）与TMB类似。不同之处在于只有少数TMB中的突变会产生多肽，经过修饰加工并加载到MHC复合体上，且更少的突变能够被T细胞识别［66-68］。通常情况下，肿瘤TMB越高，产生新抗原的可能性也越高。有研究显示，TMB与肿瘤细胞表面HLA分子上递呈的TNB高度相关［69-71］。除点突变可产生新抗原外，插入和缺失（InDels）产生的移码突变也可使其产生多条新的肽链。每条新的肽链可能形成多个新抗原多肽，从而获得更高的免疫治疗应答率［72］。此外，在接受过继T细胞治疗的恶性黑色素瘤患者中，TMB和TNB水平也可以预测患者对T细胞免疫治疗的疗效［73］。

新抗原的产生和特异性识别是肿瘤免疫的基石，多项临床研究证实TNB在预测接受免疫治疗的肿瘤患者PFS和OS中具有重要作用［10,29,71,73-74］。但是，新抗原的计算过程远比TMB复杂，因此尚未在临床上广泛应用［75］。