气相色谱-质谱联用法(GC-MS)测定烟酸普鲁卡因中的对甲基苯胺

徐森彪

(英格尔检测技术服务(上海)有限公司，上海 201109)

盐酸普鲁卡因能使神经细胞兴奋阈值升高，丧失兴奋性和传导性，信息传递被阻断，临床上具有良好的局部麻醉作用，但盐酸普鲁卡因在生产和贮存中都容易产生特殊性杂质对氨基苯甲酸(PABA)，PABA在一定条件下还会脱羟形成有毒的苯胺，从而影响盐酸普鲁卡因药品的质量，同时也增加了药品在服用过程中的风险和不确定性.对甲基苯胺是强烈的高铁血红蛋白形成剂，并能刺激膀胱尿道，致血尿，为了保证盐酸普鲁卡因药品的质量安全，建立盐酸普鲁卡因中对甲基苯胺含量快速、准确的检测十分必要.

目前，国内外还没有对甲基苯胺的检测方法.一般而言，对于有机化合物的检测比较常用的方法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法(GC-MS)和高效液相色谱-质谱(HPLC-MS).近年来，由于质谱检测灵敏度高、定性定量稳定可靠以及抗干扰能力强等优点被广大检测工作者所认可，使得色谱-质谱联用方法应用广泛.

本研究建立了一种盐酸普鲁卡因中对甲基苯胺的GC-MS分析方法.该方法具有前处理简单、检出限低、准确度和精密度高的优点.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

(1) 仪器：7890B-7000D型气相色谱质谱联用仪(美国安捷伦公司)；

(2) 电子天平(Sartorius，BSA224S)：德国赛多利斯公司，感量为0.1 mg;

(3) 超纯水系统：Milli-Q型，密理博中国有限公司；

(4) 涡旋混合器： VORTEX 3000型，德国Wiggens公司；

(5) 试剂：对甲基苯胺(Dr.Ehrensorfer，德国，纯度：99.5%，Lot：114193)；

对甲基苯胺贮备液Ⅰ：差减法称取对甲基苯胺标准品0.024 3 g于10.00 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，计算得浓度为2 430 μg/mL.

对甲基苯胺贮备液Ⅱ：移液枪准确移取205 μL对甲基苯胺贮备液Ⅰ于10.00 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，计算得浓度为50 μg/mL.

对甲基苯胺贮备液Ⅲ：移液枪准确移取100 μL对甲基苯胺贮备液Ⅱ于10.00 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，计算得浓度为500 ng/mL.

(6) 甲醇：HPLC级，赛默飞世尔(中国)有限公司.

(7) 实验用水为一级水，符合 GB/T6682-2008 要求.

1.2 方法原理烟酸普鲁卡因样品中的对甲基苯胺经甲醇提取，净化后经气相色谱-质谱联用仪检测，根据保留时间、碎片离子质荷比及其丰度定性，与校准曲线比较定量.

1.3 仪器工作条件色谱条件：DB-624色谱柱(30 m×0.32 mm×1.8 μm，美国安捷伦科技有限公司)，程序升温60 ℃(2 min)-5 ℃/min-100 ℃(0 min)-20 ℃/min-260 ℃(3 min)，柱温60 ℃；进样口220 ℃，进样量1 μL，流速1.5 mL/min；进样模式：分流进样；分流比：50∶1；

质谱条件：传输线温度270 ℃，离子源温度230 ℃，四级杆温度100 ℃，电离模式：EI，扫描模式：SIM，m/z 106.1/107.1/77.1，碰撞能量：70 eV.

1.4 测定方法

1.4.1 样品处理 称取0.200 0 g样品，置于20 mL刻度管中，加入5 mL甲醇，室温震荡提取10 min后，于4 ℃下4 500 r/min转速离心5 min，吸取上清液1 mL过0.22 μm针式尼龙滤膜于色谱进样瓶中，上机测试.

1.4.2 分析步骤 在6只10.00 mL容量瓶中，分别加入对甲基苯胺贮备液Ⅲ 0.00、0.15、0.30、0.50、1.00、2.00 mL，用甲醇定容至刻度，即得0.00、15.0、30.0、50.0、100、200 ng/mL对甲基苯胺标准系列.

2 结果

准确配制一系列不同浓度对甲基苯胺的低浓度标准品溶液，按本方法进样，获取标准品信噪比结果.直至信噪比接近3∶1，将该溶液进样6次，检出浓度为2.50 ng/mL，以称样量0.200 g，定容体积10.00 mL计算，得检出限为0.125 mg/kg.

表1 对甲基苯胺检出限信噪比数据

Quantitation results

CompoundRTTransition(T)Transition(Q)T-rsepQ-rsepS/NR2Final conc.UnitsP-toluidine14.353106.1107.179 90961 1299.60.997 732.052 8ng/mL

图1 对甲基苯胺检出限浓度色谱图

表2 回收率试验(n=3)

图2 空白稀释液谱

结果发现，空白稀释液、样品溶液、对甲基苯胺标准溶液和样品溶液加标测得值稳定，不存在干扰现象.

2.5 耐用性实验为考察本方法测试条件在略微改变的状况下对准确性的影响，分别略微改变进样口温度(±1 ℃)，流速(±0.1 mL/min)及柱温起始温度(±1 ℃).配制对甲基苯胺标准溶液，平行进样5次，并计算其浓度和回收率的相对标准偏差(RSD/%).

结果发现，略微改变进样口温度(±1 ℃)，流速(±0.1 mL/min)及柱温起始温度(±1 ℃)，本方法在对甲基苯胺的保留时间和响应值方面无显著影响.

图3 对甲基苯胺标准溶液(32 ng/mL)谱

图4 样品溶液谱图(样品溶液浓度为20 mg/mL)

3 讨论

3.1 仪器选择GC-MS是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物，用电子轰击方式得到的谱图可以与标准谱库(NIST谱库)进行比对.HPLC-MS主要解决极性、难挥发、热不稳定和大分子量化合物的分析.对甲基苯胺沸点200 ℃，分子质量107.15，相对密度0.961 9(20.4 ℃)，能随水蒸气挥发，鉴于其物理化学性质，选择使用GC-MS分析盐酸普鲁卡因中对甲基苯胺的含量.

图5 样品溶液加标(加标浓度32 ng/mL)谱

表3 对甲基苯胺耐用性结果(n=5)

3.2 提取条件的选择盐酸普鲁卡因在水中易溶，在乙醇中略溶，在氯仿中微溶，在乙醚中几乎不溶，根据目标化合物对甲基苯胺微溶于水，溶于甲醇、乙醇、乙醚、二硫化碳和油类，溶于稀无机酸并生成盐的性质，采用加标回收试验方法，比较了乙醇、乙醚、二硫化碳和甲醇4种不同提取试剂对盐酸普鲁卡因中对甲基苯胺的提取效率.结果证明，采用甲醇和乙醇作为提取试剂时，回收率较高，尤其是选用甲醇提取的回收率更好，乙醚和二硫化碳回收率偏低，不能满足测定的要求.因此选择了甲醇作为对甲基苯胺的提取试剂.

在室温下震荡提取盐酸普鲁卡因中对甲基苯胺5、10、15、20、25 min的提取效率，结果表明，10 min以后并无明显增加，因此，确定提取时间为10 min.

3.4 色谱条件优化快速有效分离一个复杂样品，并获得满意结果，除了选择一根合适的色谱柱以外，还要对分离操作条件进行仔细的选择.

本研究比较了1 μL和2 μL的进样量，进样量1 μL时峰形更好，气化更充分；柱温是一个重要的操作参数，直接影响分离效能和分析速度，在分流比为50∶1，柱温60 ℃条件下，色谱峰分离良好.对甲基苯胺的沸点为200 ℃，因此选择进样口温度为220 ℃，程序升温最高温度为260 ℃，从而保证样品溶液能够完全气化和在色谱中分离流出.

本研究采用GC-MS联用法测定盐酸普卡因中对甲基苯胺的含量，方法灵敏，操作简便，准确度高.方法线性范围、精密度、准确度、专属性和耐用性均能满足检测的要求.