盐胁迫鼠李糖乳杆菌富硒工艺研究

徐 颖，杨玉洁，何成艳，贺佳璇，魏丽娜，邬淑芳

(陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021)

0 引言

硒元素不仅有抗氧化、抗衰老、保护和修复细胞等作用，还可以起到提高机体免疫能力、解毒、排毒的功能[1,2].人类的某些疾病与硒元素缺乏有关，如克山病与大骨节病等.乳酸菌可以适应人体肠道环境并生长繁殖，起到调节人体肠道菌群、预防腹泻以及改善人体肠道功能等作用[3-5].乳酸菌还可以将无机硒转化为有机硒而更有利于机体吸收利用，相对于人工转化而言，既便宜又安全[6-8].前期研究表明，鼠李糖乳杆菌是在相同条件下富硒效果较好的乳酸菌菌种，但富硒量不高，本课题利用一定浓度氯化钠溶液胁迫鼠李糖乳杆菌，研究其在盐胁迫条件下富硒的最优条件，为该菌株应用于富硒发酵食品工业提供理论基础.

陈卫等[9]研究显示，高盐会使乳酸菌的一些基因表达增加，而这些基因可能参与相容性物质的合成或吸收过程.赵山山[10]利用RNA-seq技术研究植物乳杆菌ST-III在盐耐受时的整体反应，结果表明，盐的添加对植物乳杆菌ST-III的转录水平产生了影响，包括氨基酸转运及代谢、无机离子平衡、碳水化合物转运及代谢、细胞壁/膜/包膜的生物合成和DNA复制、重组、修复等.当植物乳杆菌ST-III在高盐(6% NaCl)浓度下培养时，与低盐(2% NaCl)浓度下培养时相比，更多编码无机离子转运体、相容性溶质转运体及DNA修复相关基因的表达量发生了变化.在添加了盐及亚硒酸钠的培养基中培养鼠李糖乳杆菌，推测高盐可能使其基因转录水平发生了改变，从而更多的编码无机离子转运体、相容性溶质转运体蛋白，吸收更多的无机硒进入菌体内，从而提高了富硒率.对于鼠李糖乳杆菌盐胁迫富硒基于基因水平的探索和生物转化的机制都将成为后续实验的研究内容，有待于进一步探究.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus，ATCC 53103)由实验室提供;亚硒酸钠，山东西亚化学工业有限公司；MRS培养基，北京陆桥技术股份有限公司.其他试剂均为常见分析纯.

1.2 仪器

电感耦合等离子发射光谱仪，美国Thermofisher公司；其他均为实验室常见仪器.

1.3 实验方法

1.3.1 菌种的活化

将0.3～0.5 mL经高温高压灭菌后的MRS肉汤培养基注入冻干管中，用移液枪轻轻吹打，使之充分溶解成菌悬液.将菌悬液全部打入2个试管中，培养活化成功后，将各菌株接种到液体MRS培养基中，在恒温培养箱中静置37 ℃下培养24 h为一代，连续活化三代.

1.3.2 单因素实验

(1)最佳NaCl浓度的确定

配制4%、5%、6%、7%、8%、9%六种不同盐浓度梯度的NaCl溶液、0.17 mg/mL亚硒酸钠溶液和空白MRS液体培养基并预先灭菌，将增殖活化好的种子液接种1 mL于不同含盐浓度富硒液体培养基中，同时做空白对照，37 ℃下恒温培养48 h，测定菌体中硒的含量，重复操作3次取平均值，按公式(1)和(2)计算富硒率和富硒量，比较富硒量和富硒率确定最佳盐浓度.

富硒率=有机硒含量/总硒含量

(1)

富硒量(μg/g)=

菌体细胞内硒含量/菌体细胞干质量

(2)

(2)最佳pH的确定

配制pH值分别为5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5六个梯度的MRS液体培养基、0.17 mg/mL的亚硒酸钠溶液以及8%盐溶液并预先灭好菌，将增殖活化好的菌液接种1 mL于盐胁迫富硒液体培养基中，在37 ℃下恒温培养48 h，重复(1)中操作.

(3)最佳培养温度的确定

保持其他条件不变，将预先增殖活化好的种子液接种1 mL于盐胁迫富硒液体培养基中，分别在35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃下恒温培养48 h.重复(1)中操作.

1.3.3 富硒量的测定

电感耦合等离子发射光谱法(ICP)测定硒含量，菌液离心得菌体，烘干至恒重，称重后放入带刻度具玻璃塞10 mL试管中，用硝酸-高氯酸(5∶1，V/V)混酸消化，方法详见文献[11]，公式(1)和公式(2)计算富硒量和富硒率.

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1 最佳NaCl浓度的确定

将鼠李糖乳杆菌在NaCl浓度分别为0、4%、5%、6%、7%、8%、9%的盐胁迫富硒培养条件下37 ℃恒温培养48 h后，绘制菌株在不同盐浓度条件下的富硒量及富硒率的曲线图，如图1及图2所示.

图1 不同盐浓度胁迫下菌株的富硒量

图2 不同盐浓度胁迫下菌株的富硒率

由图1可知，随着盐浓度的增加，菌株的富硒量呈先增加后减少的趋势，而当盐浓度达到8% 时，此时富硒量达到最大值2 050μg/g.由图2可知，随着盐浓度的增加，菌株的富硒率呈先上升后下降的趋势，而当盐浓度增加到8%时,菌株的富硒率最高为54.23%.林松洋等[12]表明乳酸菌的耐盐机制涉及到细胞内的许多调控系统，如相容性溶质调控系统、糖酵解关键酶调控系统、热休克蛋白调控系统以及胞内离子平衡等.NaCl是一种促氧化剂，会对细菌细胞造成氧化损伤，而且可以诱导与非典型的条件相适应的蛋白质的表达.也有研究表明高盐环境会使某些蛋白质的基因表达上调.故推测盐胁迫刺激了鼠李糖乳杆菌的某些蛋白质基因表达上调，从而提高了盐胁迫下菌株的富硒效果.由图1也可得到一定的盐浓度会促进菌株富硒，但是当盐浓度高于8% 时菌株富硒量及富硒率均呈降低趋势，推测可能是因为盐浓度过高造成了一定的细胞损伤.综上可知，鼠李糖乳杆菌盐胁迫富硒的较好盐浓度为8%.

有研究表明乳酸菌的耐盐性主要是通过吸收一些相容性物质来调节渗透压实现的.目前发现在乳酸菌中有许多菌种都可以从外界吸收甜菜碱、肉碱、胆碱及脯氨酸等相容性物质.高盐条件也会改变细菌细胞膜的组成，如膜脂组成的改变，特别是修饰脂质头部基团的改变,会影响相容性溶质转运体的活性[12,13].高渗透压会导致细胞膜上的磷脂数量发生变化，这个变化可能会导致蛋白质与蛋白质之间的相互作用发生变化，从而改变膜蛋白的功能[14,15].所以鼠李糖乳杆菌在高盐条件下可能会通过吸收相容性物质来调节自身渗透压，从而在高盐调节下正常生长繁殖.

2.1.2 最佳培养pH的确定

将鼠李糖乳杆菌在pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的盐胁迫富硒培养条件下，37 ℃恒温培养48 h后，绘制菌株在不同pH条件下的富硒量及富硒率曲线图，如图3及图4所示.

图3 不同pH培养下菌株的富硒量

图4 不同pH培养下菌株的富硒率

由图3和图4可知，随着pH的增大，菌株的富硒量及富硒率都呈先上升后下降的趋势，当pH值达到6.0时，菌株的富硒量及富硒率都达到最大值，最高富硒量为2 377.65μg/g，最大富硒率为52.15%.田会芹等[16]表明环境pH会对细菌的生命活动产生重要影响，pH的改变会引起细胞膜电荷变化，进而影响细菌对营养物质的吸收，影响代谢过程中酶的活性，改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性.鼠李糖乳杆菌的最适pH为5.5至6.2，pH值过高或过低会影响菌株代谢过程中酶的活性，或培养基中的营养物质受到pH变化的影响产生变化，从而对菌株的富硒效果产生抑制作用.pH值大于6.0后，菌株的富硒量及富硒率都开始下降.综上可知，鼠李糖乳杆菌盐胁迫富硒的较好培养pH为6.0.

2.1.3 最佳培养温度的确定

将鼠李糖乳杆菌在温度分别为33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃的盐胁迫富硒培养条件下恒温培养48 h后，绘制菌株在不同培养温度下的富硒量及富硒率曲线图，如图5及图6所示.

图5 不同温度下菌株的富硒量

图6 不同温度下菌株的富硒率

由图5及6可知，当温度逐渐升高时，盐胁迫下菌株的富硒量及富硒率均呈先上升后下降的趋势.当温度达到37 ℃时，菌株的富硒量及富硒率均达到了最大值.王学良等[17]表明乳酸菌在高温条件下会产生热应激反应，热胁迫后乳酸菌会通过调控自身的防御系统来调节相关基因的表达和代谢途径，产生一系列热激蛋白以降低或消除热胁迫的伤害.而众所周知的是高温会破坏酶的活性，会使蛋白质变性及聚集.温度过高会使鼠李糖乳杆菌体内的酶失活，从而可能抑制了热应激相关蛋白质的合成，使得鼠李糖乳杆菌失去热应激反应，在高温下菌株死亡，造成富硒效果降低.因为鼠李糖乳杆菌的最适生长温度一般为30 ℃～40 ℃，所以当温度上升到高于40 ℃后，其生长受到了抑制，从而无法进行富硒的生理活动，其富硒量及富硒率都会下降.综上所述，鼠李糖乳杆菌盐胁迫富硒的较好培养温度为37 ℃.

2.2 响应面优化实验结果分析

响应面实验各因素水平如表1所示，各实验方案及实验结果如表2所示.

表1 各因素水平表

表2 各实验方案及结果

2.2.1 回归模型的建立及显著性分析

利用Design-Expert 8.0.6软件，对多项式进行回归分析，得到的二次回归方程为：

富硒率=61.37+0.37×A+0.93×B+

0.51×C-0.97×A×B+

7.500E-0.03×A×C+

1.44×B×C-12.92×A2+

0.78×B2-0.47×C2

(3)

由式(3)可以看出，在影响富硒率的各因素中，一次项的偏回归方程的系数的绝对值由小到大依次为：A

由表3可知，模型的Prob>F的值小于0.000 1，方程极为显著.失拟项Prob>F值大于0.05不显著.R2为0.987 8，表示该回归模型可以反映98.78%的响应值，则可以用该模型来分析响应值.

表3 回归模型的方差分析表

续表3

2.2.2 各因素的交互作用对富硒率的影响

各因素的交互作用对菌株富硒率影响如图7、8、9所示.由图可知，温度和pH的交互作用对富硒率的影响最显著，盐浓度和温度、盐浓度和pH的交互作用对富硒率的影响不显著.

(a)pH与温度对鼠李糖乳杆菌富硒率影响3D曲面图

(b)pH与温度对鼠李糖乳杆菌富硒率影响等高线图图7 pH与温度对鼠李糖乳杆菌富硒率影响的响应面图及等高线图

(a)pH与盐浓度对鼠李糖乳杆菌富硒率影响3D曲面图

(b)pH与盐浓度对鼠李糖乳杆菌富硒率影响等高线图图9 pH与盐浓度对鼠李糖乳杆菌富硒率影响的响应面图及等高线图

2.2.3 培养条件的优化结果

得到的回归方程的最大值为：温度为36.96 ℃、pH为6.5、盐浓度为9%，预期富硒率最大值为63.53%.将培养条件修正为：温度为37 ℃、pH为6.5、盐浓度为9%.验证实验最终测得的富硒率为65.35%，与优化得到的富硒率预期值相近，说明该优化结果可信.

3 结论

本研究以鼠李糖乳杆菌为研究对象，通过单因素实验研究盐浓度、培养pH、培养温度对鼠李糖乳杆菌富硒的影响，应用Design-Expert软件得出鼠李糖乳杆菌富硒培养的最佳工艺条件：最佳培养温度37 ℃、最佳盐浓度9%、最佳培养pH为6.5，预期富硒率为63.53%.在优化结果的基础上做验证实验，实验所得富硒率为65.35%，与预测的富硒率相近，说明该优化结果可信.在最佳工艺条件下，鼠李糖乳杆菌的富硒量和富硒率都显著提高，相对于未胁迫组富硒量增加了437.63μg/g，富硒率提高了14.7%.