alpha2B肾上腺素受体选择性化合物作用机制研究

刘丽艳 刘若凡 黄宁 陈军利

(四川大学华西基础医学与法医学院病理生理学教研室，四川 成都 610041)

α2肾上腺素受体(α2-adrenergic receptor，α2-AR)属于A类(视紫红质类)G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)，分为α2A, α2B和α2C三种亚型。α2-AR与去甲肾上腺素、肾上腺素等内源性配体结合，通过激活胞内偶联的G蛋白(主要是Gi/o，但也偶联Gs和Gq蛋白)，引起下游信号分子环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)水平变化，参与细胞反应[1]。不同α2-AR亚型的分布和主要功能不同，α2A-AR占中枢神经系统(Central nerve system，CNS)中的90%，主要分布在前额叶皮质(Prefrontal cortex，PFC)，主要功能是突触前负反馈抑制去甲肾上腺素释放、低血压、镇痛、镇静、抑制癫痫患者癫痫发作[2]；而α2B-AR仅在丘脑有较少的表达。对α2-AR受体亚型具有高度选择性的配体的缺乏，严重限制了α2B-AR药理学功能的探索[3]。

研究显示，使用不同长度的连接子偶联两个药效团，可增加配体-受体的亲和力和效力[4]。4-氨基喹啉类化合物是由2至12个碳原子的烷烃链连接两个4-氨基喹啉组成的化合物，对α2-AR具有较强的亲和力，其中，C7对α2B-AR具有选择性[5]。然而，C7与α2B-AR作用位点尚不清楚。本文旨在通过计算机辅助药物设计方法及药理学手段，探讨C7对α2B-AR选择性的分子机制，为研发α2B-AR选择性药物打下结构基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

COS-7细胞株，购自ATCC，培养在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中；胎牛血清购自Hyaline公司；DMEM购自Gebico公司。

1.2 方法

1.2.1α2B-AR同源模型的构建及评价

从Uniprot数据库中，检索人α2B-AR氨基酸序列(450个氨基酸，P18089)。在SWISS-MODEL中进行序列对比，搜寻与目标序列相匹配的模板。选择同源性高、分辨率低、晶体结构完整的受体作为构建同源模型的模板，进行建模。构建好的模型采用ERRAT2和Ramachandran Plot进行评分，最优模型被采用。ERRAT2的可接受范围是≥50%[6,7]。Ramachandran Plot评分值的可接受范围>90%[8-10]。

1.2.2α2B-AR同源模型loop环的优化

评分较差的loop环区域，利用MODELLER9.18进行优化，每个步骤生成50～100个模型，同样采用ERRAT2和Ramachandran Plot进行评分，选择评分最高进行下一步优化，直至所有评分较差的loop环被优化，最后采用ERRAT2和Ramachandran Plot对模型进行评价。

1.2.3分子对接(CDOCKER)

在Discovery Studio中，选定受体模型，根据模型腔定义口袋，改变结合球的大小至能够包裹胞外环，选定用于对接的小分子，设置最大命中数为100，设置“Pose Cluster Radius”为0.5，余参数默认，运行CDOCKER。

1.2.4cAMP累积实验

COS-7细胞以密度2×105·ml-1接种于不透明96孔培养板中，100μl/孔，用Lipo2000转染含α2B-AR基因的质粒DNA至COS-7细胞中，在37℃含有5%CO2的培养箱内培养48h。加无血清、双抗的DMEM高糖培养基冲洗细胞。每孔加入20 μl含有1 mM IBMX、30 μM Forskolin和不同浓度梯度(10-10～10-3M)待测药物的DMEM高糖培养基，置于在37℃含有5%CO2的培养箱中孵育30 min。待培养板静置至室温后，使用cAMP- GloTMAssay试剂盒按操作说明处理各孔细胞。最后使用酶标仪在562 nm波长下检测各孔发光强度，以反映各孔cAMP水平。

2 结果

2.1 α2B-AR同源模型的构建及优化

通过SWISS-MODEL构建α2B-AR亚型的同源模型，利用ERRAT2对同源模型进行评分，通过MODELLER对同源模型的胞内外环错误值较高的区域进行优化，并评价优化后的同源模型的质量。结果显示，ERRAT2和Ramachandran Plot对构建的α2B-AR同源模型评分分别为85.054(图1A)和94.4%(图1B)。ERRAT2评分中得分较低的区域，图中呈黑色的峰值，峰值越高，代表错误值越高，对错误区域处于loop环的氨基酸进行优化，α2B-AR优化区域位于loop环上145～170，200～215，225～245，300～310，320～330，335～345位氨基酸，每一区域的优化生成20个模型，分别用ERRAT2评分，评分最高的模型再进行下一区域的优化，最后评分最高的模型采用ERRAT2和Ramachandran Plot评分分别为93.867(图1C)和95.9%(图1D)，得到的最终模型较优化前评分增高，表明同源模型的质量进一步提高。

图1 α2B-AR同源模型优化前后的ERRAT2和Ramachandran Plot评分注：A：优化前ERRAT2评分；B：优化前，Ramachandran Plot评分；C：优化后ERRAT2评分；D：优化后，Ramachandran Plot评分。

2.2 α2B-AR同源模型的质量检测

通过CDDOCKER分子对接，对上述构建并优化的α2B-AR同源模型进行质量检测。在胺类GPCRs中，位于第Ⅲ跨膜螺旋的氨基酸残基D3.32高度保守，作用于该类受体正性位点的配基与此氨基酸有成键作用，在α2B-AR中D3.32氨基酸对应的是Asp92，据此，我们利用α2-ARs已知的激动剂去甲肾上腺素和拮抗剂酚妥拉明分别与构建的α2B-AR同源模型进行分子对接，来检验同源模型的质量。结果显示，去甲肾上腺素与α2B-AR同源模型的Asp92、Ser176、Tyr391形成离子键(图2A)，酚妥拉明与该受体Asp92、Tyr172形成离子键，与Tyr391、Phe412形成π-π键(图2C)。此外，去甲肾上腺素和酚妥拉明均位于α2B-AR的正性结合口袋(图2B，2D)。去甲肾上腺素和酚妥拉明均能与α2B-AR同源模型Asp92成键，表明我们构建的α2B-AR同源模型质量较高，可进行下一步的分子对接实验。

图2 去甲肾上腺素、酚妥拉明与α2B-AR同源模型分子对接注：A、B：去甲肾上腺素；C、D：酚妥拉明

2.3.4氨基喹啉类化合物(C7)与α2B-AR同源模型结合位点的预测

为了检测C7与α2B-AR的相互作用位点，我们通过CDDOCKER将C7与α2B-AR同源模型进行分子对接。C7与α2B-AR同源模型分子对接后产生100个对接模式，从对接模式最集中的簇中，选评分最高的对接模式进行分析。结果显示，C7与α2B-AR的Glu73形成氢键，与Tyr391、Phe408、Phe412形成π-π键(图3A)，以此推测这些位点参与C7与α2B-AR相互作用。此外，与去甲肾上腺素和酚妥拉明不同，C7位于不同于α2B-AR正性位点的胞外段(图3B)。

图3 C7与α2B-AR同源模型分子对接注：A：俯视图；B：正视图

2.4 C7对表达α2B-AR的COS-7细胞内cAMP水平的影响

去甲肾上腺素在10-10～10-3M浓度范围内可以刺激COS-7细胞内cAMP增加(纵坐标荧光检测值越低，细胞产生cAMP量越多)(图4A)，C7在10-10～10-3M浓度范围内对COS-7细胞内cAMP水平无显著影响(图4B)。

图4 不同化合物对表达α2B-AR的COS-7细胞内cAMP分子水平的影响注：A：去甲肾上腺素(NA)；B：C7

3 讨论

α2-ARs属于GPCRs的一个分支-胺类受体，分为三个亚型α2A-AR、α2B-AR、α2C-AR，其广泛分布于全身不同组织，参与调节许多的生理病理过程，因此，α2-ARs激动剂和拮抗剂的潜在治疗应用很多[11]。传统的药物研发主要靶向于GPCRs内源性配体结合位点即正性结合位点，但其高度结构同源性严重阻碍了亚型选择性配体的研发，也是其产生副作用的主要原因之一。研究显示，靶向别构结合位点进行受体亚型选择性化合物的设计是一种有效的方法[12]。别构调节剂与受体的别构调节位点结合后，会使受体分子的构象发生改变，进而使受体的正性结合位点的构象发生改变，从而增强(正向别构调节剂)或减弱(负向别构调节剂)外源性激动剂或内源性神经递质与受体的亲和力和/或效力[13]。

前期研究显示，C7对α2B-AR具有选择性。本研究首先通过计算机辅助药物设计的方法预测了C7与α2B-AR的结合模式和相互作用位点。首先，我们构建了α2B-AR同源模型，并对其进行优化，优化前后采用ERRAT2和Ramachandran Plot进行评分。ERRAT2评分是根据蛋白受体不同原子之间的非键合作用并与结构高度精细的蛋白进行对比，其优点是能够定位模型结构不佳的区域，评分50分以上可接受[7]。Ramachandran Plot可以确定蛋白质模型的立体化学结构的质量和精确度，其评分>90%可接受[10]。优化后ERRAT2错误值较高的黑色峰值区域已明显减少，Ramachandran Plot评分升高，评分均在可接受的范围内，其质量符合要求。Ramachandran Plot中有18个氨基酸在非允许区，经核对它们不位于存在别构调节位点的受体胞外区，对我们的研究影响不大，但后期我们可以对该模型进行进一步优化，以期获得更好的实验结果。

在肾上腺素受体中，其正性结合位点的氨基酸D3.32(Asp)是高度保守的，内源性配体可与此氨基酸成键[14]。分子对接结果显示，α2B-AR的激动剂去甲肾上腺素可与α2B-AR的D3.32(Asp92)，Ser176和Tyr391形成氢键，而拮抗剂酚妥拉明与α2B-ARAsp92、Tyr172形成氢键，与Tyr391、Phe412形成π-π键。以上结果表明，去甲肾上腺素和酚妥拉明均位于α2B-AR的正性结合位点，说明我们构建的α2B-AR同源模型质量较高。C7与α2B-AR的分子对接结果显示，C7与该受体的Asp92没有成键作用，但是可与受体胞外区域的Glu73形成氢键，与Tyr391、Phe408、Phe412形成π-π键，说明C7可能是通过一种的新的作用方式，即别构调节作用，与α2B-AR结合，进而影响下游信号。

cAMP累积实验结果显示，去甲肾上腺素作为α2-AR的激动剂，可以刺激表达α2B-AR的COS-7细胞内cAMP增加，而C7在10-10～10-3M浓度范围内对COS-7细胞内cAMP的产生没有影响。说明，C7本身对α2B-AR没有激活或者抑制作用，可能会通过对α2B-AR的别构调节作用来影响下游信号的传导。

本研究首次提出了α2B-AR可能存在的别构调节位点，为将来研发α2B-AR选择性药物打下结构基础。