雌激素调控小鼠大脑皮质及海马PCSK9表达*

张荔 李汉娜 张雪芹 岳利民△

(1. 四川大学华西基础医学与法医学院；2.四川大学华西基础医学与法医学院生理学教研室，四川 成都 610041)

卵巢分泌的雌激素除了影响生殖系统的结构和功能外，同样影响机体代谢及其他系统功能活动，尤其对中枢神经系统的功能活动存在重要的调节作用。围绝经期女性的卵巢功能开始逐渐减退至衰竭，导致外周血清雌激素水平降低，进而使得卵泡刺激素(Follicle-stimulating-hormone，FSH)短暂负反馈性上升。由于雌激素匮乏，绝经女性神经系统的功能活动也发生一系列与衰老相关的退行性病变。大量证据表明，绝经期女性阿尔兹海默症(Alzheimer′s disease，AD)、帕金森综合症(Parkinson′s disease，PD)，以及脑卒中(Stroke)和多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)[1,2]发病率明显上升，尤其是与脂代谢紧密相关的AD在绝经后女性中发病率是男性的2-3倍[3]。并且，绝经前行双侧卵巢切除术则引起神经退行性疾病发生的可能性进一步增加[4]。动物实验及流行病学调查均表明，绝经后雌激素替代治疗(Oestrogen-replacement therapy，ERT)对认知和记忆功能有明显的改善作用[5-7]。然而雌激素对神经系统的保护作用机制目前尚不明确。

中枢神经系统的结构和功能都与脂质稳态维持有关[8]，雌激素也与脂质稳态的维持存在密切关系。美国国家健康和营养调查(NHANES)结果显示，55岁-64岁女性平均低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL-C)水平相比35岁-44岁女性增高24%左右，同比之下，男性LDL-C水平差异仅为6%[9]。双侧卵巢切除术后血清LDL-C异常增加，与年龄相关的LDL-C增加趋势相似，说明雌激素对降低血清LDL-C起着重要作用[10]。

人类枯草溶菌素转化酶9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)是近年来发现的脂代谢负调控因子，通过与低密度脂蛋白受体(Low density lipoprotein receptor，LDLR)结合，使细胞膜LDLR内吞降解，从而减少可循环利用的LDLR数量，引起血清LDL-C异常增高，进而诱发高脂血症[11-13]。PCSK9在脑中也有相应表达，而且在AD患者脑脊液中PCSK9表达明显增加，参与AD的发病过程[14]。而LDL-C水平的异常增高也与AD等神经退行性疾病存在密切联系[15,16]。也有文献报导女性循环系统中雌激素与PCSK9呈负相关[17]，绝经后女性循环PCSK9水平明显上升[18-20]。

本实验分别以去势雌性小鼠及回补雌激素后的去势小鼠作为实验对象，分别用RT-qPCR，免疫组化，Western Blot及HE染色研究小鼠脑内PCSK9定位表达及雌激素是否影响脑内PCSK9表达，据此分析雌激素缺乏是否通过影响PCSK9表达进而参与神经系统相关病变的发病，从而为围绝经期后的神经系统疾病的发病机制研究提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

SPF级雌性C57BL/6J小鼠，6周龄，13-15 g，购自成都达硕生物科技有限公司(SCXK(川)2015-030)，于标准环境条件(20℃，每天12小时光照，食用专用饲料及洁净饮用水)下饲养至10周龄。

1.1.2主要试剂与抗体

ECL化学发光试剂盒、RI-PA裂解液、PMSF、BCA蛋白含量检测试剂盒均购自Beyotime公司；多聚甲醛购自Biosharp公司；氯仿、异丙醇、甘氨酸、氯化钠、戊巴比妥钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、柠檬酸钠、柠檬酸等均购自成都科龙化工试剂有限公司；兔抗鼠一抗PCSK9(1：100，55206-1-AP)由美国Proteintech公司生产；兔抗β-Actin(bs-0061R)购自美国Bioss公司；PCSK9抑制剂Alirocumab，购自美国Sanofi & Aventis；环戊丙酸雌二醇(HY-B1100)购自MCE公司；DAB显色试剂盒(ZLI-9018)以及兔SP试剂盒(SP-9001)购自中杉金桥公司；苏木素购自南京建成公司。

1.1.3主要实验仪器与设备

低温高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)、常温离心机(上海安亭科学仪器厂)、超纯水制造系统(UPH-I-20T，成都超纯科技公司)、光学显微镜及石蜡切片机(德国 Leica 公司)、垂直电泳槽以及凝胶成像系统(美国 Bio-Rad 公司)、隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器公司)、涡旋振荡仪(美国 SCILOGEX 公司)、脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造有限公司)、酶标仪(瑞士 TECAN 公司)、高压蒸汽灭菌锅(MLS-3020，日本 SANYO 公司)。

1.2 方法

1.2.1动物实验

15只10 w雌性C57BL/6J小鼠随机分成3组：对照组小鼠行假手术，术后继续饲养7 w；去势组小鼠摘除卵巢后继续饲养7 w；去势后补雌激素组小鼠于去卵巢术后4 w开始补充雌激素，每7 d皮下注射一次(1 mg·kg-1)，共三次。各组小鼠均于17 w时颈椎脱臼处死，取出全脑，从中线处切开左右脑，左脑以4%多聚甲醛固定；右脑迅速分离出海马和皮质组织，立即放入液氮中冻存用于蛋白提取。所有小鼠于取材前行阴道涂片，保证小鼠取材时均处于动情前期。

1.2.2组织学HE染色

将石蜡包埋的组织切片(4 μm)，依据HE染色标准操作进行染色，光学显微镜下观察。

1.2.3免疫组化

组织固定，石蜡包埋、切片，烤箱烘烤3 d。根据SP试剂盒说明书进行免疫组化染色。简要步骤如下：切片托拉复水，消除内源性过氧化氢酶，抗原修复，血清封闭，滴加兔抗鼠PCSK9一抗，4℃温育过夜。复温后滴加山羊抗兔二抗，后加入辣根酶标记链霉卵白工作液，应用DAB染色和苏木素复染，盐酸酒精分色，脱水透明，封片。在Motic图像处理系统下观察，并拍照记录。胞浆呈棕黄色区域为染色阳性区域。

1.2.4Western Blot

组织样品按1 g：6 ml加入蛋白裂解液(RIPA:PMSF=100:1)于冰上研磨至匀浆，低温高速离心15 min(8000 rpm，预冷4 ℃)，取上清后置于-80 ℃冰箱保存待用。按说明书使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样品蛋白浓度。

进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉的TBST中封闭2 h；将PVDF膜置于封闭液稀释的1：1000的兔抗鼠PCSK9中，4℃孵育过夜；将PVDF膜放入用TBST按1:4000稀释的辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)中(TBST稀释)，置于37℃环境中保持1 h；使用ECL试剂盒(碧云天，中国)处理，化学发光显色，在BIO-RAD凝胶成像系统下观察，并拍照记录。

1.2.5统计处理

2 结果

2.1 PCSK9表达定位于海马及皮质

HE染色可见小鼠海马组织CA3、CA2、CA1区形态(图1A)。免疫组化染色结果显示，小鼠脑内PCSK9表达于海马及大脑皮质神经元胞浆(图1B)。Western Blot检测也进一步确定了PCSK9蛋白在海马及大脑皮质的表达，其表达量无明显差异(图1C，D)。

图1 PCSK9在小鼠海马及皮质的定位与表达注：A：HE染色显示海马CA3、CA2、CA1区形态；B：免疫组化检测PCSK9在脑内表达于海马及大脑皮质神经元胞浆；C：Western Blot检测海马及皮质PCSK9蛋白表达情况；D：WB灰度分析

2.2 雌激素负调控海马PCSK9蛋白表达

去势组小鼠海马组织较对照组小鼠PCSK9表达增加(P<0.05)；而回补雌激素后，PCSK9含量较去势组明显降低，甚至低于假手术组(P<0.001)，见图2。

图2 雌激素负调控海马PCSK9蛋白表达注：A 免疫组化染色；B 光密度分析

2.3 雌激素负调控大脑皮质PCSK9蛋白表达

与海马相似，去势后小鼠大脑皮质PCSK9蛋白表达较对照组有增加(P<0.05)；回补雌激素有效降低了PCSK9蛋白表达，同样低于假手术组(P<0.001)，见图3。

图3 雌激素负调控大脑皮质PCSK9蛋白表达注：A 免疫组化染色；B 光密度分析

3 讨论

本研究目的在于探讨雌激素缺乏是否会导致脂代谢负调控因子PCSK9脑内异常表达。为此，我们将雌性小鼠进行去势处理，模拟卵巢功能衰退所致雌激素水平降低状态，部分去势小鼠外源性补充雌激素，检测各组小鼠脑内PCSK9的表达及定位。结果显示，PCSK9主要表达于脑内海马及大脑皮质，雌激素缺乏使该蛋白表达异常增加，回补雌激素使该蛋白的表达显著减少，甚至低于假手术组。

据文献报道，雌激素能够改善海马的记忆效应[21，22]。在围绝经期及时补充雌激素能有效改善女性认知功能衰退及降低相关神经退行性疾病的发病风险[23]。神经系统功能活动与脑内脂质稳态的维持之间存在密切关系[24]。雌激素对中枢神经功能的影响可能与其对脂代谢的调控有关。围绝经期妇女补充雌激素后可改善其脂代谢紊乱状态，从而有利于神经退行性疾病的防治[25]。近年新发现的PCSK9这一脂代谢负调控因子不仅能影响外周循环系统脂质稳态，也影响脑内脂代谢[26，27]。脑内海马区是学习记忆形成及长时记忆储存转换的重要部位[28]，大脑皮质同样参与学习记忆过程[29，30]。根据功能的不同，海马又被分为CA1区，CA2区，CA3区。在AD的发病过程中，海马这些区域的β淀粉样斑块形成及神经纤维纠缠极大程度上导致了AD患者记忆功能衰退的发生。还有研究报导，高脂血症小鼠海马神经元PCSK9升高的同时，β-分泌酶(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme-1，BACE1)这一与AD发病有关的蛋白酶的表达水平也随之升高，表明脂代谢紊乱所诱发的神经凋亡也与PCSK9异常表达有关[26]。

已经有研究者证明在外周组织，PCSK9通过结合肝细胞膜表面的LDLR，减少肝脏胆固醇摄取从而造成高脂血症，显然，在中枢神经系统中，PCSK9同样参与到了局部脂质稳态的维持。神经系统富含功能性脂质，雌激素可以通过非受体介导途径调节脂质稳态从而改善神经系统相关病变[31]，而围绝经期雌激素缺乏所导致的脂代谢紊乱可能导致神经系统认知功能的改变[24]。本研究结果揭示PCSK9在脑内主要表达定位于小鼠海马及大脑皮质，并且其表达水平受到雌激素的负调控作用，据此不难推测，在女性围绝经期后，由于雌激素缺乏，PCSK9这一脂代谢负调控因子表达的上调，也可能影响脑组织局部胆固醇摄取利用，导致脑组织局部脂代谢紊乱，进而引发一系列神经系统退行性改变。本研究所得结果表明PCSK9在小鼠脑内海马及大脑皮质表达，雌激素缺乏使其表达量异常增加，补充雌激素可以减少其表达。至于补充雌激素后海马及皮质区的PCSK9表达甚至低于假手术对照，可能是外源补充的雌激素水平与去卵巢前雌激素生理量差异所致。本研究结果揭示了围绝经期女性雌激素缺乏所致中枢神经系统退行性疾病的一个重要的病理因素，从而为围绝经期女性神经系统退行性疾病的诊断和治疗研究提供了新线索。