黄腐酚体外抑制STAT3信号发挥抗肝癌作用

李雨含 王祎

(1. 四川大学华西口腔医学院；2. 四川大学华西基础医学与法医学院病理生理学教研室，四川 成都 610041)

肝癌是严重危害人类生命和健康的常见恶性肿瘤之一，揭示其发病机制，探寻潜在药物靶点是当今肿瘤治疗的主要研究策略[1]。信号转导及转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)作为一个转录因子，主要调节细胞周期、细胞存活、血管生成以及免疫反应等过程。当STAT3被上游酪氨酸激酶磷酸化后，可形成二聚体，进而转位入核与其调控的靶基因位点的DNA结合，引起靶基因的转录翻译[2]。目前发现，STAT3的靶基因大多与促增殖、抗凋亡、血管生成、转移、免疫逃避等肿瘤发生发展过程中的生物学行为密切相关[3]。在正常细胞，STAT3具有短暂活化而后迅速失活的特性，然而研究者发现在70%的人类实体肿瘤中，STAT3处于持续高活性状态[4]。因此，STAT3是一个极具前景的抗肿瘤药物靶点。

啤酒花(HumuluslypulusLinn.)是众所周知的酿酒原料，并作为民间药物被长期使用。黄腐酚(Xanthohumol，XN)是啤酒花中分离得到一种异戊烯类黄酮化合物。近年来黄腐酚的药用价值受到广泛的关注，研究证实黄腐酚具有较强的抗炎和抗肿瘤活性，并能增强放化疗导致的乳腺癌细胞凋亡[5, 6]。此外，还有报道称黄腐酚可通抑制多重耐药基因(Multidrug resistance 1，MDR1)和表皮生长因子受体(Epithelial growth factor receptor，EGFR)等信号通路介导肿瘤细胞凋亡[6]。然而对黄腐酚对肝癌细胞的杀伤作用及其具体的分子机制尚未见文献报道。

本研究采用人类肝癌细胞系BEL-7402及SMMC-7721为研究模型，揭示黄腐酚在抗肝癌治疗中的潜在价值和作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与细胞

黄腐酚(Xanthohumol，XN)，购自成都普思生物有限公司，以DMSO溶解，配制成100 mM的母液，-20℃保存备用。人肝癌细胞株BEL-7402及SMMC-7721，购自上海吉凯生物有限公司，置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在含5%CO2的37℃环境中培养。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)购自Sigma-Aldrich。CCK8试剂盒及ECL化学发光底物，购自碧云天。磷酸化及非磷酸化的STAT3、cyclin D1、Bcl2、GAPDH等抗体，由Signal Antibody提供。HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG，购自Proteintech。PVDF膜，购自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1细胞活力检测

BEL-7402和SMMC-7721肝癌细胞，按照5000个/孔的密度接种于96孔板中。孵育过夜后，加入不同浓度的黄腐酚(0-40 μM)继续分别处理24 h和48 h[7]。随后，每孔加入10 μL的CCK8试剂，37℃孵育2 h，450 nm处检测吸光度值。

1.2.2细胞核染色

BEL-7402细胞以黄腐酚处理24 h后，随后以4%多聚甲醛固定15 min,加入DAPI(0.5 μg·mL-1)置于暗处染色5min。最后于倒置荧光显微镜(IX53，Olympus)下观察细胞核染色情况。当细胞核出现荧光强度升高，染色质固缩，细胞核破碎等情况时，则可视为细胞凋亡。随机选取3个视野，计算凋亡细胞比率。

1.2.3Western blotting

BEL-7402细胞以黄腐酚处理24 h后，弃去培养基，以PBS洗2次。随后，加入含有1%蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解15 min。收集细胞裂解液后，12000 g，4 ℃离心5 min，取上清液，加入5×Loading buffer，100 ℃煮沸10 min。接着，将等量的样品上样至SDS-PAGE胶，经电泳转膜至PVDF膜，以5%的脱脂牛奶室温封闭1 h。随后，加入不同的一抗(1：1000)，4 ℃孵育过夜。随后，回收一抗，以TBST洗3次后，加入二抗(1：5000)室温孵育1 h。最后，以TBST洗3次后，ECL进行曝光显影。采用Quantity One软件对条带进行定量分析。

1.2.4统计分析

所有的统计分析均以Graphpad Prism 5.0软件进行，数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析，当P<0.05时视为有显著性差异。

2 结果

2.1 黄腐酚对肝癌细胞增殖的影响

如图1所示，黄腐酚(2～40 μM)分别处理肝癌细胞株BEL-7402及SMMC-7721 2 h-48 h后，细胞活力受到明显影响，其抑制效率最高可达80%(P<0.01)，并呈现剂量依赖性。

图1 CCK8法检测黄腐酚对肝癌细胞增殖的影响注：BEL-7402(A)和SMMC-7721(B)细胞增殖情况。数据以平均值±标准差表示，n=3。与溶媒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

2.2 黄腐酚对肝癌细胞凋亡的影响

与溶剂对照组相比，黄腐酚(20 μM和40 μM)处理组的细胞核出现荧光强度升高，染色质固缩(箭头所示)和细胞核破碎(三角形所示)。计数分析结果表明，20 μM和40 μM黄腐酚处理24 h可致40%和70%的BEL-7402细胞凋亡，见图2。

图2 黄腐酚对肝癌细胞凋亡的影响注：(A)典型的细胞凋亡图片，标尺=40 μm。(B)凋亡细胞比(%)。数据以平均值±标准差表示，n=3。与溶媒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

2.3 免疫印迹检测黄腐酚对肝癌细胞中STAT3活化的影响

与溶媒对照组相比，黄腐酚(5～20 μM)能明显抑制肝癌细胞中STAT3的磷酸化(P<0.01)，且呈现一定的剂量依赖性。半定量分析结果表明，10 μM和20 μM黄腐酚处理24 h，对STAT3磷酸化的抑制率约为35%和55%。然而，黄腐酚对STAT3的表达没有明显影响，见图3。

图3 黄腐酚对肝癌细胞中STAT3活化的影响注：(A)典型的Western blotting电泳图；(B)半定量分析。数据以平均值±标准差表示，n=3。与溶媒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

2.4 免疫印迹检测黄腐酚对肝癌细胞中STAT3靶基因表达的影响

如图4所示，与溶媒对照组比较，黄腐酚(5～20 μM)能剂量依赖性地抑制BEL-7402细胞中STAT3靶基因Bcl-2和cyclin D1的表达。半定量结果显示，在20 μM黄腐酚处理的肝癌细胞中，Bcl-2和cyclin D1的表达下调达到了70%和50%(P<0.0001)。

图4 黄腐酚对肝癌细胞中STAT3靶基因表达的影响注：(A)典型的Western blotting电泳图；(B)半定量分析。数据以平均值±标准差表示，n=3。与溶媒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

3 讨论

STAT3是包括肝癌在内的多种肿瘤发生发展以及耐药性阐释的关键调控蛋白，因此通过靶向STAT3为肝癌的治疗提供了潜在的可能性。前期，Dokduang等人发现黄腐酚能抑制胆管癌细胞中由白介素6(IL-6)诱导的STAT3活化[8]。然而，黄腐酚对肝癌等癌细胞中组成型活化的STAT3的影响并未涉及。在本研究中，我们发现，黄腐酚能有效抑制肝细胞癌细胞中STAT3的组成性活化。同时，黄腐酚也能有效STAT3的靶基因，从而发挥抑制肝细胞癌细胞生长的作用。我们的结果表明，黄腐酚具有预防和治疗肝癌的潜在价值。

除了能够调节与增殖凋亡相关基因的转录翻译外，STAT3还能上调一系列与免疫抑制相关基因的表达，如环氧化酶2(Cyclooxygenase2，COX2)和程序性死亡配体1(Programmed cell death protein 1 ligand 1，PD-L1)等[9, 10]。同时，有研究表明，黄腐酚能够有效抑制巨噬细胞中由脂多糖诱导的COX2表达[11]。因此，黄腐酚有可能通过抑制STAT3进而抑制了免疫抑制基因COX2等的表达，从而增强了抗肿瘤免疫反应。黄腐酚这一作用在肝癌的免疫治疗领域具有较强的潜在应用价值。

综上所述，黄腐酚通过抑制STAT3的组成型活化，从而发挥抗肝癌的作用。然而，对于其抑制STAT3活化的具体机制，还需进一步研究。