应用孕妇血浆中胎儿游离DNA进行产前筛查的临床研究进展

李晓洲，史云芳，琚端，李岩，张颖

孕妇血浆中的胎儿游离DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）可通过高通量测序（high-throughput sequencing，HTS）技术即二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术进行精确检测，并应用于胎儿染色体非整倍体疾病的无创产前检测（noninvasive prenatal testing，NIPT）。目前NIPT 技术是指胎儿染色体非整倍体异常产前筛查技术，主要应用于21三体综合征（trisomy 21 syndrome，T21）、18三体综合征（trisomy 18 syndrome，T18）和13三体综合征（trisomy 13 syndrome，T13）的产前筛查。随着对cffDNA研究的不断深入，其应用范围已扩展至单基因遗传性疾病、胎儿性别鉴定、胎儿Rh血型鉴定、胎儿染色体拷贝数变异（copy number variants，CNVs）等多个领域。而随着NIPT临床研究的不断深入，尤其是对其假阳性、假阴性及检测失败病例的深入分析，临床工作者对NIPT 的临床应用范围亦有了新的认识。本文就应用孕妇血浆中cffDNA 进行NIPT 的临床研究进展及其影响因素进行综述，为个体化、规范化应用NIPT技术提供参考。

1 胎儿染色体非整倍体疾病筛查的意义与现状

妊娠合并遗传性疾病或出生缺陷的比例约为5%［1］。我国“健康中国2030”规划中将“减少出生缺陷”列为工作重点内容，而超过80%的出生缺陷疾病是由遗传因素单独或协同作用导致的［2］。胎儿染色体非整倍体异常是引起出生缺陷的最主要原因，也是引起新生儿及儿童死亡的主要原因之一［1，3］。目前对此尚缺乏有效的治疗手段，且患者预后极差。孕期可通过羊膜腔穿刺、绒毛取材或脐带血穿刺等有创方式获得胎儿细胞，进行相关疾病的产前诊断，但这些产前诊断方法均属于有创性检查且技术复杂。目前国内外的普遍做法是先通过经济、简便、无创的产前筛查手段，筛查出高风险人群，再采用各种产前诊断方法进一步明确诊断。

高龄孕妇、血清学筛查高风险和超声“软指标”异常是产前诊断的主要指征，但据此针对胎儿T21的检出率为60%～80%，阳性预测值约为5%［4-6］，因此无法实现全面预防控制出生缺陷。与传统产前筛查技术相比，基于cffDNA 检测的NIPT 技术可明显提高T21 和T18 的检出率及阳性预测值，并显著降低其假阳性率［7］。有文献报道，采用NIPT 技术进行T21 产前筛查的检出率约为 99.7%［8］，但对 T18、T13和性染色体非整倍体（sex chromosome aneuploidies，SCA）产前筛查的检出率均低于T21，分别为98.2%、99.0%和95.8%［8-9］；并且SCA 患者出生时往往无明显临床症状，短期的新生儿随访难以发现SCA，故NIPT对胎儿SCA的检出率尚需长期随访数据支持。即便如此，NIPT技术已明显提高了胎儿染色体非整倍体疾病的检出率［4-9］，但其临床应用仍需规范指导。

2 cffDNA进行染色体非整倍体筛查的基本原理

1997年《Lancet》上首次报道了从孕妇外周血的血浆中发现了cffDNA，其来自于胎儿的DNA 片段，因携带了胎儿的遗传信息，可以用来检测胎儿的遗传性疾病，为NIPT 技术的临床应用开辟了新纪元［10］。机体的造血细胞和体细胞在细胞凋亡的过程中，会产生一些DNA 片段游离于血浆中，即游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）片段，cfDNA 基因组谱可反映个体的染色体情况。在妊娠期间，胎盘滋养层细胞和少数胎儿细胞在细胞凋亡过程中产生的cffDNA 也被释放到母体血浆中［11］。cffDNA 基因谱亦可反映胎儿的染色体情况，故可以用来检测胎儿染色体异常［12］。

2011年以来，分子生物学技术快速发展，NGS技术可对母体血浆中的cffDNA 进行精准测序及染色体定位，从而进行胎儿染色体非整倍体的NIPT 检测。目前，大规模并行测序（massive parallel sequencing，MPS）技术是最常用的全基因组测序方法，也是进行 cffDNA 筛查的主要测序技术［9，13］。部分靶向测序技术也可用于检测母体血浆中的cffDNA，如单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）测 序［14］和 染 色 体 靶 向 测 序（chromosome-targeted sequencing，CTS）［15］。基于不同测序技术的NIPT 方案，各有其优劣势。SNPNIPT和CTS-NIPT方案具有成本低和敏感度稳定等优势，但仅能获得目标区域的cffDNA 片段信息［14-15］。与之相比，MPS-NIPT方案可得到全基因组的cffDNA序列信息，除可检测胎儿整个染色体组非整倍体异常之外，也可检测由罗氏易位以及染色体微缺失和微重复引起的染色体异常［9，13］。我国各地进行NIPT 检测主要采用MPS-NIPT 方法，其在北美和亚欧等许多国家亦获得广泛的临床应用［9］。

3 NIPT应用指南

cffDNA用于NIPT检测以来，国际学术团体相继发表指导意见和专家共识。2012年，美国妇产科学会 （American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）发表《胎儿染色体非整倍体的NIPT 检测》，指出cffDNA 对各染色体筛查的特异度和敏感度存在差异，针对21 号染色体最高，其他染色体略低［16］。2013 年，美国遗传和基因组学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）发表《ACMG 指南：胎儿染色体非整倍体的NIPT 筛查》，自愿检查、知情决策、专业遗传咨询和明确临床路径是NIPT应用的基本原则，并建议将其检测范围限定于T21、T18和T13，检测对象限定于胎儿染色体非整倍体高风险孕妇［17］。2015 年ACMG又对指南做了更新，提出在充分告知患者NIPT检测的检出率、特异度、阳性预测值和阴性预测值的前提下，一般风险孕妇也可以选择NIPT检测［18］。

NIPT 是一种筛查方法，而不是诊断方法。Badeau 等［19］对 NIPT 的产前筛查价值进行荟萃分析显示，NIPT 用于筛查 T21、T18 和 T13 胎儿的敏感度为95.8%～99.7%，特异度＞99%。我国卫生健康委员会发布的《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》将NIPT 定位为血清学筛查的补充，若孕妇具有产前诊断指征或者存在影响NIPT 结果的因素，则为cffDNA 筛查的慎用人群或不适用人群，但工作中仍需根据不同孕妇的实际情况个体化选择产前筛查和产前诊断方案。

4 影响NIPT检测结果的因素

4.1 母体因素 由于NIPT 技术需要检测孕妇血浆中的cffDNA片段，若母血中cffDNA含量低于4%，可导致NIPT 检测失败。据文献报道，NIPT 检测失败率约为0.3%［20］。母体的一些疾病状态可以增加母体细胞凋亡，但是胎盘细胞凋亡并不随之增加，在孕妇血浆中这些细胞代谢产生的cfDNA，来自母体的cfDNA 比例增加，而cffDNA 比例相对减少，可导致NIPT检测失败［21］。有研究表明，肥胖孕妇尤其是体质量指数（BMI）＞35 kg/m2的孕妇，血浆中cfDNA 来自母体的比例明显增加，其原因可能与脂肪细胞坏死、凋亡增加有关；而cffDNA片段相对不足，可导致NIPT 检测失败，失败率约为2.2%［21-22］。另外，活动性自身免疫性疾病也可以加快细胞代谢，使母体产生的cfDNA增加。有学者通过MPS和甲基化测序技术对系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）患者血浆DNA 片段的生物学特性进行分析发现，SLE 患者血浆中cfDNA 含量明显增加且表达谱系异常［23］。SLE孕妇血浆中来自母体的cfDNA比例增加，则cffDNA 片段相对不足，导致NIPT 检测失败；而cfDNA表达谱系异常亦可引起NIPT的假阳性结果［22-24］。此外，孕期药物摄入也可影响血浆中cfDNA 的含量，例如孕期注射低分子肝素可使cfDNA 含量明显增加［25］；孕妇服用降压药或抗生素等药物可使cffDNA 低于4%的比例明显增加，导致NIPT 检测失败［26］。另有研究显示，吸烟、妊娠期合并高血压、恶性肿瘤等因素均可导致NIPT 检测失败［22，27］。

孕妇患有淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、白血病和结直肠癌等恶性肿瘤可导致NIPT 检测出现假阳性结果［24，27-29］。2013 年 Osborne 等［24］首次报道了母体恶性肿瘤可以导致NIPT的假阳性结果，分析其原因是肿瘤细胞基因组中DNA 片段存在多个重复和缺失区域，使得患者和参考DNA之间的预期比率发生偏差，导致检测失败或异常的多个染色体非整倍体。有文献报道在39 例NIPT 结果提示多条染色体非整倍体异常病例中，7 例可归因于母体的无症状恶性肿瘤［27］。因此，孕妇进行 cffDNA 的 NIPT 检测前应注意母体恶性肿瘤的影响。也有学者据此提出，可以评估cfDNA 作为癌症早期生物标志物的潜力［27-29］。另外，孕妇染色体异常（主要为性染色体结构或数目异常）、染色体嵌合异常、染色体拷贝数变异均可引起NIPT的假阳性结果。此外，对于存在器官移植或异体输血史的孕妇，若其引入的外源细胞为染色体非整倍体，其代谢产生的cfDNA 片段释放入血浆中，亦可导致NIPT的假阳性结果［22，27］。

4.2 胎儿因素 有文献报道，双胎妊娠可通过NIPT进行胎儿染色体非整倍体筛查，尤其是针对T21 的筛查，但由于NIPT 检测的cffDNA 主要来源于胎盘组织，双胎的绒毛膜性可能影响NIPT 的检测结果［30-31］。对于双绒毛膜双胎来说，NIPT 检测可按照2 个胎儿处理；对于单绒毛膜双胎来说，若2 个胎儿遗传物质相同，可按单胎处理［30］；若2个胎儿遗传物质不同，需按照2个胎儿处理，胎盘与胎儿之间染色体情况差异可能会造成NIPT 检测的假阴性结果［30-31］。若双胎其中之一因染色体非整倍体而发生胎停育可导致NIPT的假阳性结果，其原因可能是发生胎停育的一胎仍可不断向母体血浆中释放DNA片段，其影响可持续7～8 周，一般不超过12～14周［32］。尹爱华教授团队通过对432 例双胎的NIPT结果进行分析发现，NIPT用于双胎妊娠胎儿染色体非整倍体筛查的敏感度和特异度分别为100%和99.53%［33］。但是，NIPT在双胎中的应用尚缺少大样本的临床数据，因此对双胎妊娠胎儿染色体非整倍体的筛查价值尚需大样本临床研究验证。

局限性胎盘嵌合（confined placental mosaicism，CPM）是引起NIPT结果与胎儿染色体核型不一致的最常见原因［34］。染色体嵌合是指在一个个体内发现2个及以上具有不同染色体核型的细胞系。嵌合现象可以在所有组织中发生，也可局限于特定组织。在妊娠期间，异常细胞系可能局限于胎盘，即CPM［35］。在NIPT检测时，CPM会干扰其结果的准确性。如果异常细胞系存在于胎盘，而正常二倍体细胞系存在于胎儿组织，可造成NIPT 的假阳性结果；反之，如果正常二倍体细胞系局限于胎盘，而胎儿存在T21、T18和T13，则可造成NIPT的假阴性结果［36］。Kypri 等［37］的前瞻性研究显示，NIPT 检测T21、T18、T13 和SCA 的阳性预测值分别为100%、100%、71%和57%，与CPM 发生率呈负相关，这也是进行NIPT检测T13和SCA假阳性率较高的原因之一。

综上所述，通过检测孕妇血浆中cffDNA 进行NIPT对筛查胎儿染色体非整倍体异常（尤其是T21）具有较好的临床价值和应用前景，但孕妇的疾病状态及孕期用药情况、双胎妊娠或妊娠过程中CPM的发生均会影响NIPT的检测结果，因此临床应用时需要注意。