GC-MS/MS 法测定桂丁香中β-谷甾醇含量
2020-01-06支荣荣周会芹
支荣荣，周会芹，郑 灏
盐城市食品药品监督检验中心，盐城 224055
桂丁香为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的干燥带宿萼的未成熟果实，别名肉桂子、桂丁等，入药始见于《百草镜》，《纲目拾遗》引其曰：桂丁“形如吴茱萸，出广西交趾，乃肉桂子也”，所述与今相符。主产广西、广东、福建。具有温里散寒、止痛、止呃的功效[1]。桂丁香含挥发油，油中含桂皮醛（Cinnamaldehyde）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、香豆精（coumarin）、胆碱（choline）等[2]。
桂丁香为江苏省地方中药材，收载于《江苏省中药饮片炮制规范》（2002 年版）。本次“标准”修订提出了增加组织显微鉴定、薄层色谱鉴别和HPLC 法测定桂皮醛含量的改进草案。桂丁香中的β-谷甾醇具有抗炎、止咳、抗溃疡、保护胃黏膜、抗癌、抗氧化和降低胆固醇及降血糖的药理作用[3-5]。胡曙晨等[6]建立了β-谷甾醇的薄层色谱鉴别方法，目前还没有报道桂丁香中β-谷甾醇的含量测定方法，为进一步提高质控标准，现以β-谷甾醇含量为指标，建立其含量测定方法。
1 仪器与药品、试剂
1.1 仪器
Agilent7890D 型气相色谱仪，7000D 三重四极杆质谱检测器；BP211D、BT224S 电子天平（德国Sartorius）。
1.2 药品与试剂
桂丁香样品8 批，购自亳州药材市场及盐城市中药饮片有限公司，经原江苏省食品药品监督检验研究院狄恒建主任中药师鉴定确认。
β-谷甾醇对照品（纯度98%，中国食品药品检定研究院）；其余试剂为分析纯；水为纯净水。
2 方法与结果
2.1 仪器条件
2.1.1 色谱条件 色谱柱：安捷伦HP-5MS 毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；进样口温度：320 ℃，检测器温度：345 ℃，程序升温（起始温度160 ℃，以20 ℃·min-1升至290 ℃，保持15 min）；分流比：8∶1，进样量：1 μL。
2.1.2 质谱条件[7，8]EI 源；电子轰击能量70 eV；离子源温度300 ℃；四级杆温度150 ℃；质谱接口温度280℃；溶剂延迟时间6min；碰撞气（氮气）流速1.5mL·min-1；猝灭气（氦气）流速2.25 mL·min-1；采用多反应监测模式（MRM），对β-谷甾醇进行一级质谱全扫描〔质荷比（m/z）50～500〕，选择响应较强的质荷比（m/z）为329.0 的碎片作为母离子，再对该母离子进行子离子扫描〔质荷比（m/z）50～329〕，确定定性离子对（m/z）329.0/95.2 和定量离子对329.0/189.2。
质谱扫描图见图1～2，对照品溶液及供试品溶液质谱图见图3～4。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 精密称取β-谷甾醇对照品9.94 mg，置50 mL 量瓶中，加二氯甲烷溶解、稀释至刻度，混匀，作为对照品贮备液（0.198 8 mg·mL-1）。精密量取贮备液1 mL 置10 mL 量瓶中，加二氯甲烷稀释至刻度，混匀，作为对照品溶液（19.88 μg·mL-1）。
图1 β-谷甾醇一级全扫描质谱图
图2 母离子扫描质谱图
图3 β-谷甾醇对照品质谱图
图4 桂丁香供试品质谱图
2.2.2 供试品溶液 取本品粉末（过3 号筛）2.5 g，精密称定，加入二氯甲烷适量，回流至提取液近无色（约3 h），收集提取液，回收溶剂至干，固体物加二氯甲烷适量溶解，定容至10 mL 量瓶中，精密量取5 mL，加在中性氧化铝柱上，用二氯甲烷50 mL洗脱，收集洗脱液，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3 线性范围考察
分别精密吸取对照品贮备液0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5 mL，置10 mL 量瓶中，加二氯甲烷至刻度，混匀。精密吸取上述溶液1 μL，注入气相色谱仪，测得峰面积。以β-谷甾醇浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算得线性回归方程：Y=1.2842×104X-9.5718×104，（r=0.999 5）。
结果表明，β-谷甾醇在4.97～49.7 ng 范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.4 进样精密度试验
精密吸取对照品溶液（19.88 μg·mL-1），按“2.1”仪器条件测定，重复进样6 次，平均峰面积（n=6）为25 743，RSD 为1.2%，表明精密度良好。
2.5 稳定性考察
按“2.2.2”项方法制备供试溶液，按“2.1”仪器条件测定，分别于0、4、8、12、16、24 h 进样，平均峰面积（n=6）为22 806，RSD 为1.1%，结果表明供试品溶液在24 h 内稳定。
2.6 重复性试验
精密称取同一供试品，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液6 份，按“2.1”仪器条件测定，β-谷甾醇的平均含量（n=6）为0.077%，RSD 为1.6%，结果表明重复性良好。
2.7 加样回收率试验
精密称取已知含量的样品（含量0.077%，以干燥品计）1.25 g，共6 份，分别精密加入对照品贮备液（0.198 8 mg·mL-1）5 mL（含β-谷甾醇0.994 0 mg），按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”仪器条件测定，计算回收率，结果见表1。
表1 加样回收试验结果（n=6）
2.8 样品测定
取8 个不同批次桂丁香样品，按照“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”仪器条件测定，以干燥品计算，各批次含量分别为0.038%、0.050%、0.077%、0.078%、0.087%、0.062%、0.081%、0.071%。
3 讨论
3.1 测定方法的选择
β-谷甾醇无紫外最大吸收，蒸发光散射法、火焰离子化气相色谱法（FID）的灵敏度较低，因此，采用气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）测定β-谷甾醇含量，以多反应离子监测模式（MRM）采集信号，具有专属性强、检测灵敏度高、重复性好等特点。
3.2 色谱条件的确定
在使用GC-MS/MS 测定β-谷甾醇之前，首先采用FID 检测器对β-谷甾醇进行色谱条件的优化，发现柱温对β-谷甾醇的峰形及分离度有较大影响。尝试采用270℃柱温[7，8]时β-谷甾醇峰形较好，但是有一杂质峰与待测成分分离度不能达到要求，当温度提高到290 ℃时，该杂质与待测成分完全分离（安捷伦HP-5 毛细管柱可以耐受最高350 ℃）。
进样口温度按照《中国药典》要求高于柱温30～50 ℃，因此选择了320 ℃，检测器温度一般高于进样口温度，选择了345 ℃，程序升温（起始温度160 ℃，以20 ℃·min-1升至290 ℃，保持15 min），以此可先分离出杂质碎片。分流比的选择考察了2∶1、4∶1、8∶1、10∶1、20∶1；分流比过大，响应值低，分流比过小，有拖尾现象，因此选择8∶1。
3.3 供试品溶液的制备
因供试品杂质较多，β-谷甾醇的响应值较低，采用二氯甲烷索氏提取，提取液浓缩至10 mL 的方法，减少稀释倍数，提高待测成分的浓度，用FID 检测器，致β-谷甾醇响应值有所提高，可达到定量限要求。供试品浓度太大，杂质太多，对色谱柱与检测器的耐受性有影响，因此选择了灵敏度更高的GCMS/MS 进行测定。对供试品作了进一步稀释，并增加了柱层析的步骤，有效减少了杂质的影响。
