瑞舒伐他汀钙片体内外一致性评价研究*

李 攀，薛敏华，唐 婉，石蓓佳，杭太俊，陆益红**

1 中国药科大学药物分析系，南京 210009；2 江苏省食品药品监督检验研究院，南京 210019；3 徐州医科大学药物分析教研室，徐州 221004

开展仿制药一致性评价，保障仿制药在质量和疗效上与原研药一致，在临床上实现与原研药相互替代，不仅可以节约医疗费用，也有助于提升我国仿制药质量和制药行业的整体发展水平，保证公众用药安全有效。仿制药能替代原研药在临床上使用的前提，是仿制制剂与指定的参比制剂药学等效（Pharmaceutical equivalence，PE）和生物等效（bioequivalence，BE），以此证明仿制制剂具有与参比制剂相同的质量和疗效。对于固体口服制剂PE 的重要组成部分是考察仿制药和原研药在多种不同pH溶出介质中的溶出行为的相似性，这是对口服固体制剂内在质量评价的最主要方法。然而，体外溶出曲线相似性评价仅模拟表征了药物在胃肠道中的释放和溶解过程，虽然可以提高仿制药生物等效的可能性，却难以准确地表征药物在体内的真实过程，因此，需要进行BE 研究以确保仿制药与原研药疗效的一致性。

软件模拟被广泛地应用于药物体内药代动力学的研究[1]，它可以为体内外相关性研究、BE 试验的设计提供帮助。本文采用的GastroPlusTM软件内置了独有的高级房室吸收与转运模型（advanced compartmental absorption and transit model，ACAT），它按生理学特征将胃肠道分为9 个房室，考虑了药物在胃肠道中的6 种状态，可以构建药物特异性胃肠道吸收模型[2，3]。其基于生理学的药代动力学（physiologically based pharmacokinetic，PBPK）模型考虑了解剖学和生理学以及药物和制剂的物理化学性质，描述了药物吸收、分布、代谢和排泄的动力学过程[4，5]。将药物的理化性质参数输入到ACAT 模型用于表征药物的胃肠道吸收和转运，建立药物的PBPK 模型用于表征药物的处置过程，将药物的体外溶出曲线导入到软件中，以评估制剂的溶出行为对药物体内过程的影响；因此，结合体外溶出曲线相似性评价，同时采用计算机软件模拟技术的建模，可以模拟药物在体内的过程[6]。

瑞舒伐他汀钙（Rosuvastatin Calcium）为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，由日本盐野义制药株式会社于20 世纪80 年代末合成，后由英国阿斯利康公司开发研制，临床用于调节血脂。国内已有多个厂家对瑞舒伐他汀钙片进行仿制[7-9]。从体外溶出曲线研究和体内生物等效性评价两个方面系统评价国产瑞舒伐他汀钙片，关于这方面的研究，尚未见文献报道。

本研究结合瑞舒伐他汀钙的BCS 特性，使用体外溶出曲线和GastroplusTM评估瑞舒伐他汀钙片国产仿制制剂与参比制剂的生物等效性，并与临床试验结果对比，验证模拟BE 的可行性，以及软件评估的可靠性，为仿制药的一致性评价提供参考。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Sciex API 5000 三重四级杆质谱仪（配有ESI源及Analyst 定量处理软件，美国Sciex 公司）；岛津LC20 高相液相色谱仪（SPD-M20A，日本Shimadzu公司）；AT7 smart 自动溶出仪（瑞士Sotax 公司）；ZKT-18F 真空脱气机（天津天大天发科技有限公司）；XSE205 十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Seven Excellence 多参数测定仪（瑞士梅特勒-托利多公司）；0.45 μm 针头滤膜（PES 和尼龙，上海安谱实验科技股份有限公司）。

GastroPlusTM（版本9.5.0004，Simulations Plus，Inc.，Lancaster，CA，USA）。

1.2 药品与试剂

参比制剂（R）瑞舒伐他汀钙片（规格10 mg，批号131343、131347、131358，AstraZeneca UK Limited 公司）；仿制制剂（T）（规格10 mg，批号171701、170702、170703，A 制药公司）；瑞舒伐他汀钙对照品（纯度97.6%，批号101028-201202，中国食品药品检定研究院）；瑞舒伐他汀钙-d6（纯度98.65%，批号2-WEN-131-1，加拿大TRC 公司）。

盐酸、氢氧化钠、柠檬酸三钠二水合物、柠檬酸一水合物、乙酸钠、冰醋酸、磷酸均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merck KGaA 公司）；甲酸（色谱纯，美国Anaqua Chemical 公司）；溶出介质试验用水：超纯水，均采用脱气装置经40 ℃脱气30 min 后立即使用。

2 方法

2.1 体外溶出曲线相似性评价

2.1.1 pH-溶解度曲线的测定 将过量的瑞舒伐他汀钙分别加入pH 值为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的缓冲液中，在37 ℃振摇24 h，使成饱和溶液，滤过，取续滤液适量，用25%乙腈适宜倍数稀释后采用HPLC 法[10]测定峰面积，按外标法计算溶液中瑞舒伐他汀的含量，从而确定在不同pH 值缓冲液中瑞舒伐他汀的饱和溶解度。当释放介质的体积为药物饱和溶液所需介质体积的至少3 倍量时，认为满足漏槽条件[11]，可作为体外溶出相似性评价的介质。

2.1.2 体外溶出测试 比较进口注册标准（JX20030283）[12]，瑞舒伐他汀钙片的溶出度检查项下溶出介质（pH 6.6 枸橼酸盐缓冲液）、健康人体胃中生理液pH（0.1 mol·L-1盐酸溶液）以及“普通口服固体制剂溶出曲线测定与比较指导原则”[10]推荐的溶出介质（pH 4.5）。参照“普通口服固体制剂溶出度试验技术指导原则”[13]，最终选择0.1 mol·L-1盐酸（pH 1.0）、pH 4.5 醋酸盐缓冲液、pH 6.6 枸橼酸盐缓冲液作为溶出介质，对两制剂进行溶出曲线研究。

取仿制制剂（T）和参比制剂（R）各3 批（n=12），照溶出度与释放度测定法（《中国药典》2015 年版通则0931 第二法）分别以3 种介质900 mL 为溶出介质，转速为50 r·min-1，依法操作，在5、10、20、30、45、60 min 时，分别取样10 mL 并及时补液。将取出的溶液滤过，取续滤液作为供试品溶液；另精密称取瑞舒伐他汀钙对照品适量，加溶出介质并定量稀释制成每毫升中约含10 μg 的溶液作为对照品溶液，参照瑞舒伐他汀钙片进口注册标准（JX20030283）[12]溶出度项下的色谱条件测定，色谱条件为：

色谱柱：Waters X-Bridge C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相：磷酸-水-乙腈（1∶600∶400）；检测波长：242 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL。典型色谱图如图1 所示。

图1 体外溶出测试典型色谱图

2.1.3 数据分析 当仿制制剂和参比制剂在15 min时的平均溶出量均不低于85%时，认为两者的溶出曲线相似；否则，用相似因子（f2）法比较溶出曲线相似性[14]。当f2值不小于50 时，认为两条溶出曲线相似，否则认为不相似[14，15]。以下等式定义f2：

其中Rt和Tt表示在时间点（t）的参比和仿制制剂的平均溶出百分数，n 是比较平均溶出时间点的数量。

2.2 体内药代动力学研究

2.2.1 研究对象 依据CFDA 最新颁布的“生物等效性指南”对生物等效性试验入组受试者性别的建议：研究将拟用于两种性别的人群；且FDA 关于瑞舒伐他汀钙的Clinical Pharmacology Biopharmaceutics Review 中一则生物等效性试验所用受试者例数为31 例，另一则为32 例。参考以上情况，试验拟入组30 例健康受试者，实际入组28 例，男性18例，女性10 例，20～43 周岁，体重不低于50 kg，体重指数（BMI）在19.0～26.0 kg·m-1，无吸烟、嗜酒史，全面体检各项指标均正常。

受试者试验开始前3 个月内未参加其它任何药物临床试验，且6 周内未服用任何药物。受试者本人签署知情同意书，并经浙江大学医学院附属第二医院人体研究伦理委员会审批同意。

受试者随机分为2 组，禁食10～12 h 后，空腹口服仿制制剂（批号170701）或参比制剂（批号131343）1 片，用250 mL 温开水吞服药物，受试者口服药物前0 h（服药前0.5 h 内）和服药后0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0、16.0、24.0、36.0、48.0、72.0 h 分别于肘静脉取血约2.5 mL，分别置于含EDTA-2K 抗凝试管中，试管提前置于冰上预冷。4 ℃、3 000 r·min-1离心10 min。吸取上层血浆，-80 ℃保存，供血药浓度测定用。

2.2.2 分析方法 以瑞舒伐他汀钙-d6作为内标，100 μL 血浆样品经甲醇沉淀蛋白，采用经过验证的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法检测血浆样本中瑞舒伐他汀的浓度。

色谱条件：色谱柱：SunFireTMC18（2.1mm×50mm，3.5 μm）；流动相A：0.1%甲酸水溶液，B：0.1%甲酸乙腈溶液[梯度：0～2 min（35%B～70%B）；2.05～3.50 min（95%B～95%B）；3.55～5 min（35%B～35%B）]；流速：0.6 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

质谱条件：采用大气压电喷雾离子源（ESI+）；正离子模式，选择多反应离子监测（MRM），用于定量的离子反应为：瑞舒伐他汀选择性反应监测：m/z 482.2→m/z 258.2，瑞舒伐他汀-d6选择性反应监测：m/z 488.2→m/z 264.2。

2.2.3 数据统计分析 使用Phoenix WinNonlin Version 7.0 以非房室模型进行PK 分析，药代动力学参数包括：Cmax、AUC0-t、AUC0-∞、Tmax。使用SAS Version 9.2 对主要药动学参数Cmax、AUC0-t、AUC0-∞经对数转换后进行方差分析及双单侧t 检验，并计算90%置信区间，考察仿制制剂与参比制剂的生物等效性，如果Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的几何平均比（仿制/参比）的90%置信区间在80.00%～125.00%，则认为两制剂生物等效[16]。相对生物利用度的计算公式为

（AUC0-t）T 为仿制制剂的AUC0-t，（AUC0-t）R 为参比制剂的AUC0-t。

2.3 群体药代动力学模拟

利用GastroPlusTM模拟软件构建虚拟群体（n=28，20～50 岁，健康中国人，男性和女性均50%）模拟单次口服每种瑞舒伐他汀钙片的体内药代动力学。模型建立参数见表1。计算每个虚拟受试者的Cmax、Tmax、AUC0-∞和AUC0-t。报告中位数和直接采用5%和95%的结果表示90%的置信区间。

表1 模型建立参数收集

3 结果

3.1 pH-溶解度曲线的测定

瑞舒伐他汀钙在不同pH 缓冲液中的溶解度曲线见图2。随着pH 增加，溶解度先上升后下降。药物在各种pH 条件下的溶解度均大于0.041 7 mg·mL-1（以瑞舒伐他汀10 mg 计），满足漏槽条件，各介质均可作为瑞舒伐他汀钙片的溶出介质。

图2 瑞舒伐他汀钙在不同pH 缓冲液中的溶解度曲线

图3 两种瑞舒伐他汀钙片在3 种溶出介质中的溶出曲线

3.2 体外溶出测试

仿制制剂（T）和参比制剂（R）在3 种溶出介质中的溶出曲线如图3 所示。数据表示为±s（n=12）。

3.2.1 盐酸（pH 1.0）溶液中的溶出曲线相似性评价3 批参比制剂在15 min 时的平均累积溶出量均大于85%，3 批仿制制剂在15 min 时的平均累积溶出量小于85%（图3-A），因此计算f2因子评价仿制制剂与参比制剂体外溶出相似性。除仿制品批号170703 的f2因子为49，其他2 个仿制品批号的f2因子均大于50（见表2），认为仿制制剂与参比制剂在该介质中的体外溶出曲线基本相似。

表2 在pH 1.0 溶出介质中的f2因子计算结果统计

3.2.2 醋酸盐缓冲液（pH 4.5）中的溶出曲线相似性评价 3 批参比制剂在15 min 时的平均累积溶出量均小于85%，仿制制剂均不低于85%（图3-B）。经计算f2因子均小于50（见表3），说明仿制制剂与参比制剂的体外溶出曲线不相似。

表3 在pH 4.5 的溶出介质中的f2因子计算结果统计

3.2.3 枸橼酸盐缓冲液（pH 6.6）中的溶出曲线相似性评价 虽然参比制剂的溶出速率较仿制制剂稍慢，但15 min 几乎完全溶出（＞85%）（见图3-C）。仿制制剂与参比制剂的体外溶出曲线相似。

3.3 体内药代动力学研究

28 例健康受试者单次口服瑞舒伐他汀钙片10 mg，仿制制剂和参比制剂平均血药浓度-时间曲线见图4，两者变化趋势基本一致。生物等效性分析结果见表4，仿制制剂的相对生物利用度F 为95.65%±17.62%（AUC0-t）。Cmax的几何均值比的90%CI 为84.09%～104.70%，AUC0-t的几何均值比的90%CI 为88.32%～103.58%，AUC0-∞的几何均值比的90%CI 为94.17%～105.28%，均在80%～125%的范围内，两制剂无统计学差异，具有生物等效性。

图4 28 名健康志愿者单次口服瑞舒伐他汀钙片受试制剂（T）和参比制剂（R）10 mg 后的平均药物浓度-时间曲线（±s）

表4 生物等效性研究参数统计

3.4 群体药代动力学模拟

图5 显示了参比制剂和仿制制剂在虚拟的28名健康成年中国人中的群体药代动力学研究结果，点代表实测的平均血药浓度，线代表预测的平均血药浓度。两制剂药代动力学参数的预测值和实测值见表5。主要药代动力学参数Cmax和AUC 的预测误差（%PE）不大于10%；Tmax的%PE 稍高，但小于20%，且参比制剂说明书报告了单次口服10 mg 瑞舒伐他汀钙片后Tmax的中位值为2.5～5 h，模拟值分别为3.24（R）和3.25（T），仍可接受[17]。

综上，认为GastroPlusTM建立的群体药代动力学模型较为合理的描述了单次口服瑞舒伐他汀钙片的药代动力学特征。虚拟BE 结果显示Cmax的几何均值比（T/R）的90%CI 为86.44%～112.44%，AUC0-t的几何均值比的90%CI 为91.36%～118.80%，AUC0-∞的几何均值比的90%CI 为91.35%～118.80%，均在80%～125%的范围内，两制剂具有生物等效性。

图5 参比制剂（R）和仿制制剂（T）虚拟模拟28 个健康成年中国人PK 曲线

表5 口服不同瑞舒伐他汀钙片药代动力学参数结果（±s）

表5 口服不同瑞舒伐他汀钙片药代动力学参数结果（±s）

*%PE=（模拟值-实测值）/实测值×100%

4 讨论

瑞舒伐他汀钙在pH 1.0 盐酸溶液中不稳定，降解产生杂质B、D 及少量未知杂质，在此介质中的溶出曲线，均以主峰和酸降解产物的峰面积和计算[18]。经试验考察，杂质B 的相对校正因子为1.0，杂质D为0.9，在0.9～1.1 范围内，且仿制药和参比制剂降解程度差异不大（见表6）。因此，采用上述文献方法计算瑞舒伐他汀钙在pH 1.0 盐酸溶液中的溶出曲线，更科学合理。在pH 4.5 醋酸盐缓冲液中，仿制制剂与参比制剂的溶出曲线不相似，原因可能是参比制剂中含有碱性辅料磷酸钙，对制剂溶出有所影响。虚拟BE 试验和临床BE 试验结果均表明仿制制剂与参比制剂生物等效，且仿制制剂已通过一致性评价。综上认为，仿制制剂在pH 4.5 的醋酸盐缓冲液中的溶出速率与参比制剂不相似，对药物的体内PK 影响不大，仅仅通过体外溶出曲线相似性评价不能准确反映瑞舒伐他汀钙片的体内过程。

参比制剂在pH 1.0 的盐酸溶液中的溶出速率快于仿制制剂，而在pH 4.5 和pH 6.6 的介质中的溶出速率慢于仿制制剂，可能是由于仿制制剂的包衣层与辅料及生产工艺与参比制剂不一致导致的。由于临床BE 试验结果显示两制剂各PK 参数不存在显著差异，说明制剂经胃肠道到达吸收部位时，药物已基本完全溶出，溶出速率的差异被均一化。

表6 两制剂在pH 1.0 盐酸溶液中降解情况统计

对比实测的和模拟的药代动力学曲线，软件在吸收相拟合良好；在消除相，模拟比实测的消除稍慢，可能是由于模型建立所用的清除率和分布容积等数据是基于白种人的静脉滴注数据计算得到，与中国人存在差异导致的。尽管虚拟BE 和实际临床试验的药动学参数存在一定差异，但结果均显示仿制品与参比品生物等效。虚拟BE 试验为仿制药一致性评价工作的临床前研究提供了一种新的思路，即体外-PK 建模-体内研究。为制剂处方筛选和BE临床试验设计提供指导，降低制剂生物不等效风险，缩短药物的研发周期。GastroPlusTM等计算机模拟技术可用于仿制药一致性评价研究中。