CPNE7在口腔组织再生中的相关研究进展

刘紫奇，葛少华

钙磷脂结合蛋白Ⅶ(calcium phospholipid-binding protein Ⅶ，Copine Ⅶ，CPNE7)最初主要被认为在促进肿瘤发生中发挥作用。近年来随着研究的深入，发现CPNE7主要由前成釉细胞分泌，在细胞发育过程中易位进入前成牙本质细胞参与牙齿发育的整个过程。随着组织工程学及再生医学的发展，CPNE7成为口腔组织再生工程的热点。CPNE7除了能够诱导牙源性/非牙源性细胞向成牙本质细胞分化、促进牙本质细胞分化形成牙本质以外，在促进牙周组织再生及促进成骨方面的功能也相继被发现，其在口腔组织再生方面的潜在作用受到广泛的关注。

1 CPNE7在口腔组织再生中的发现

CPNE7最早在乳腺癌中被发现，分离并鉴定为2.6 kb的cDNA[1]，与Copine家族成员Copine Ⅰ、Copine Ⅲ和N-copine都属于钙离子依赖性磷脂结合蛋白[2-3]。

近年的研究发现，前成釉细胞培养液(preameloblast-conditioned medium，PA-CM)除了诱导牙髓再生外还能促进牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)的牙源性分化，并在体内和体外促进牙本质的形成[4-6]。然而PA-CM中含有多种蛋白衍生因子，为了鉴定其中能够促进成牙本质细胞分化和牙本质形成的新因素，2011年Lee等通过液相色谱-质谱法分析了PA-CM，检测后发现，实验组中的CPNE7可将牙本质唾液磷蛋白(dentin sialo- phosphoprotein，DSPP)启动子活性提高约3.5倍[5]，这说明CPNE7是参与成牙本质细胞分化的候选基因。基于这个发现，口腔组织再生研究者们在牙本质再生、牙周组织再生、骨再生及肿瘤等方面对CPNE7展开了全方位多角度的研究，自此CPNE7成为口腔组织再生工程的热点研究方向。

2 CPNE7促进牙本质再生及其机制

牙本质是保护牙髓的重要硬组织，而龋坏或外伤是导致牙本质缺失、牙髓暴露的两大主要因素。处理各种原因引起的意外露髓的首要目标是保存活髓，因而快速形成修复性牙本质以保护牙髓成为研究者关注的内容。牙本质再生是一个复杂的生物学过程,多种生长因子共同参与它的调控。

CPNE7作为PA-CM衍生因子，是参与成牙本质细胞分化的候选信号分子[5]。Oh等的研究发现，CPNE7是由前成釉细胞分泌的一种可扩散的信号分子，它在前成釉细胞中表达并在成釉细胞分化过程中分泌到细胞外基质中，之后易位进入成牙本质细胞调控上皮-间充质相互作用的应答反应，最终通过调控DSPP的表达来调节成牙本质细胞分化和矿化[7]。在这些研究的基础上，Seo等进一步研究发现，CPNE7由前成釉细胞易位进入成牙本质细胞的过程主要通过质膜囊泡依赖性受体介导的内吞作用完成。CPNE7先与其表面受体核仁素(Nucleolin)相结合，识别后由细胞质膜囊泡介导的内吞作用实现这一过程；同时CPNE7与受体Nucleolin结合后形成CPNE7-Nucleolin复合体，进一步调节纤毛的生成并刺激DSPP的表达，从而参与成牙本质细胞的分化及牙本质形成[8]。近期的两项研究表明CPNE7不仅与早期釉质形成中DSPP的表达有关，而且在牙齿的整个发育过程中呈动态表达，提示其在牙齿发育的每个阶段都发挥着重要作用[9-10]。

此外，有研究将CPNE7应用于比格犬牙本质缺损模型，表明用CPNE7间接盖髓可促进成牙本质细胞分化形成第三期牙本质，很好地保存了牙髓活力；同时研究人员观察到缺损牙本质下方的牙本质小管被矿物质沉积所阻塞且不存在微渗漏，但在对照组中，所有缺损处的牙本质小管均呈开放状态，这很好地证明了CPNE7能够促使缺损对应处的牙本质小管内形成牙髓牙本质复合体及修复性牙本质，可以有效改善牙本质过敏症状[11-12]。因此，CPNE7在间接盖髓并缓解牙本质敏感方面具有临床转化的潜在优势，但仍需大量临床前期实验对其作用及机制进行深入探讨。

3 CPNE7促进牙周组织再生

牙周炎是发生在牙周组织的慢性感染性疾病，以牙龈出血和炎症、牙周袋形成、牙槽骨吸收、牙齿松动和移位为主要表现，其中牙周组织的破坏是不可逆的[13]。牙周炎的理想治疗目标是获得牙周组织结构和功能的重建，通过恢复已被牙周疾病或创伤损坏的牙周组织的原始状态(包括牙周膜，牙骨质，牙槽骨或牙龈)来产生新的附着[14-15]。临床上对牙周组织再生的主要治疗方式有引导性组织再生术(guided tissue regeneration，GTR)[16]、牙周植骨术[17]、生长因子治疗等[18]。

目前有研究报道，将CPNE7应用于完全去除牙周膜的比格犬牙根表面时，CPNE7能够促进牙骨质样组织形成，但形成的牙周膜样组织的数量与对照组相比没有显著差异[19]。尽管CPNE7对牙周膜样组织形成的促进效果仍需深入研究，但值得肯定的是类牙骨质的形成为新生的牙周膜纤维样组织提供了附着位点，有利于牙周组织再生。在此基础上，一个体内实验发现CPNE7能促进牙周膜细胞中牙骨质附着蛋白(cementum attachment protein，CAP)的表达，该基因支持牙周来源的细胞附着在牙骨质上，然而CPNE7对其他成牙骨质相关基因，如成骨特异性转录因子(runt-related transcription factor 2，Runx2)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨钙素(osteocalcin，OC)、成骨相关转录因子抗体(osterix，OSX)等的表达以及牙周膜细胞的增殖、迁移没有显著影响；但在比格犬牙周缺损模型中CPNE7能够促进牙周复合体产生且可以更好地促进牙周膜样纤维的排列——使其排列与牙根部新形成的牙骨质和牙槽骨垂直，类似于Sharpey’s纤维[20]。因此，CPNE7可能通过上调CAP的表达来支持牙周膜细胞附着在牙骨质上并促进牙周膜纤维的生理排列，从而在牙周组织再生中发挥功能性作用。

另外，CPNE7能够在体外增加牙骨质样组织形成的原因可能是：CPNE7本身具有高钙离子结合力，这种钙离子亲和力可能有助于牙骨质矿化[11]；CPNE7可以在体内促进牙本质的形成，而正常的无细胞牙骨质需要形成正常的牙本质[7，21]；在牙囊细胞(dental follicle cells，DFCs)中同样可以检测到CPNE7，因而也有理由认为趋化性物质可能来自新形成的根部牙本质，通过促进DFCs迁移以促进牙骨质生成[20]。因此CPNE7具有应用于治疗临床牙周缺损，促进生理性牙周结构再生的潜力。

4 CPNE7及其衍生肽促进成骨

牙周组织再生除了需要促进牙周膜纤维恢复正常排列以外，恢复已缺损的骨组织也是必不可少的。骨组织的再生常使用生长因子和激素来诱导，例如骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)[22]，甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)[23]，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)[24]和硬化蛋白抗体(sclerosin antibody，Scl-Ab)[25]。尽管已有研究证明这些生物活性分子的成骨潜力，但由于其潜在的免疫原性、分子的不稳定性以及产生相关副作用等问题的存在，其临床应用仍然受到限制[26-27]。

2015年Fosgerau等研究发现具有安全性和相似生物活性的蛋白质片段(如肽)能够克服蛋白质生物制剂的当前缺点，与全蛋白相比，合成肽在再生治疗中具有降低免疫原性、减缓降解和降低致癌性等优势[28]。同时已经开发出的生物材料可以增强其细胞粘附性等功能[27]。

在此研究基础上，最近的研究发现CPNE7应用于间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)时具有诱导成骨的潜能[11，29-30]。2015年Oh等研究表明CPNE7可以诱导牙源性或非牙源性MSCs向成牙本质细胞分化，并易位进入成牙本质细胞诱导其形成矿化结节[29]。同年，Choung所在的研究团队通过体内外实验同时证明了前成釉细胞衍生因子是通过Runx2-OSX-BSP信号介导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)的成骨分化并促进骨形成，其中CPNE7与其他前成釉细胞来源的因子共同促进该成骨过程，但CPNE7促进成骨的具体机制仍需进一步研究[30]。随后，2016年Choung团队为探究钙与CPNE7的亲和力，对其进行了钙结合测定，结果表明CPNE7具有很强的钙离子结合能力，这说明CPNE7本身特有的高钙离子亲和力是其促进MSCs矿化成骨的原因之一[11]。

尽管CPNE7具有成骨潜力，但由于其分子尺寸较大和半衰期短的缺陷在临床应用中显示出有限的活性。为进一步解决这个问题，Lee等在最近的研究中发现CPNE7的6种衍生肽——CDP1-CDP6，它们能够穿透细胞且表现出低细胞毒性以及高诱导成骨性的特点，通过对六种生物活性合成肽成骨潜能进行测试，证明CDP4在DPSCs中的细胞穿透活性以及成骨效率是最强的；进一步的研究发现，在小鼠颅骨缺损模型中，CPNE7衍生肽CDP4与可注射凝胶相结合可促进骨再生[31]。该研究首次探明了CDP4在体内的骨再生率，尽管CDP4是一个早期释放的肽，但由CDP4诱导的骨形成效果与最有效的BMP-2的效果相当，因此CDP4很可能在临床应用中代替BMP-2，成为新一代高效骨形成剂。同时CDP4可与生物材料结合使用，并在骨组织工程领域发挥着较高的成骨功效，有望进一步实现牙周组织缺损中的骨组织再生。

5 CPNE7在肿瘤性疾病发生发展中的影响

癌症等恶性疾病的发生与基因调控有着密不可分的关系[32]，此前有研究表明CPNE7可能与乳腺癌[1]、宫颈癌[33]及白血病[34]的发生相关。Atsumi等的研究表明，与肿瘤相关的炎症可以诱导肿瘤本身或其周围的细胞释放各种因子，从而形成促进肿瘤发展的微环境，而炎症放大因子是导致炎症发生的主要机制。同时该团队证实，CPNE7作为细胞中炎症放大因子的靶基因之一参与炎症发生与癌症发展的过程。因此CPNE7与其他炎症放大因子相关基因很可能成为控制癌症发生发展的潜在治疗靶标[35]。尽管目前尚无相关文献证明CPNE7与口腔癌的发生发展有直接关系，但有证据表明慢性炎症可能是导致口腔癌发生的主要因素[36-37]，尤其是伴有牙周炎的患者，其发生口腔癌的概率是非牙周炎患者的2.66倍[37]。因此，是否可以通过调控CPNE7的表达来消除口腔炎症从而控制口腔癌的进展，将会成为我们未来研究的热点问题。

6 小 结

本文主要介绍了CPNE7作为Copine家族成员在促进牙本质再生、牙周组织再生、骨组织再生以及在癌症发生发展中的研究进展。CPNE7已被证实在口腔组织中再生中有着巨大潜力，尤其是促进牙本质再生方面。目前国内外学者已深入研究了CPNE7在促进牙本质再生方面的相关条件与机制，这为口腔组织再生工程中牙本质修复提供了新的发展前景，但相关研究一直局限于体外实验和体内动物模型，尚缺乏临床试验，有待进行临床试验加以验证。同时CPNE7在牙周组织再生和骨再生中也起到促进作用，有望在未来的研究中实现牙周炎缺损模型中牙周组织的修复再生。另外，虽然该蛋白在一些恶性疾病的发生发展中可能起到诱导作用，但致病机制仍不明确，尚需大量实验进行深入探究。总之，CPNE7在组织再生方面受到越来越多的关注，有望开辟口腔组织再生工程的新领域。