骨形态发生蛋白异源二聚体诱导成骨的研究新进展

周 健，涂业颖，赵子慕，黄必行，金佳杨，林海燕,2

Urist[1]于上世纪60年代将脱钙骨基质植入小鼠的肌肉或皮下，成功诱导异位成骨，由此推测存在一种诱导成骨因子，并于几年后首次提出骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)[2]的概念。BMPs属于TGF-β超家族成员，目前认为BMP除了具有骨诱导活性外，还在其他各器官的形态发生中发挥重要作用，因此也有研究者认为BMP应当被称为“体形态发生蛋白”[3-4]。

几乎所有BMP都形成同源二聚体或异源二聚体，且通常以同源二聚体的形式存在[5]。同源二聚体BMP-2和BMP-7经美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准，已应用于脊椎融合术、长骨缺损修复等治疗，但其临床有效应用剂量高，这不仅使治疗费用增高，且带来很多潜在的副作用，如过量成骨和非手术部位异位成骨等[6]。与同源二聚体相比，BMP异源二聚体在诱导成骨方面起效剂量更低、作用更显著[7-8]，但目前对于其具有更强诱导成骨能力的机制尚不十分清楚，应用于临床也存在诸多限制。本文就BMP异源二聚体的种类结构、作用机制和在诱导成骨方面的研究作一综述。

1 BMP异源二聚体的种类结构

活性BMP分子由两条肽链经二硫键连接组成，两条肽链相同则称为同源二聚体，两条肽链不同则称为异源二聚体[9]。不同单体构成的BMP异源二聚体具有不同功能[7,10-13]。Wang等[14]于1988年首次发现了BMP异源二聚体，这种BMP在体内诱导成骨方面表现出很高的效率。Sampath等[15]于1990年首次证明所提取的生长因子为BMP-2/7异源二聚体。

根据序列相似性及已知功能，可将人体内的BMP再分为7个亚家族：BMP-2/4；BMP-3/3b；BMP-5/6/7/8/8b；BMP-9/10；BMP-11/GDF-8；BMP-12/13/14；BMP-15/GDF-9[16]。研究发现，BMPs发挥其活性的效率似乎与两个单体的同源性有关：两个单体携带的基因同源性越少，诱导成骨能力越强[17-18]。因此，包含两条来自同一亚家族单体的BMP异源二聚体的成骨效能要强于同源二聚体；类似的，包含两条来自不同亚家族单体的BMP异源二聚体的成骨效能要强于包含两条来自同一亚家族单体的BMP异源二聚体。另外，组成二聚体的单体本身的成骨效能也对新组成的二聚体有影响，因此骨组织工程领域的研究大多集中在来自不同亚家族的两个单体组成的BMP异源二聚体，尤其是BMP-2/4(Ⅰ类BMP)和BMP-5/6/7/8/8b(Ⅱ类BMP)两个亚家族[19]。

不活跃的BMP前体蛋白经过二聚并被切割后，产生具有生物活性的BMP配体及缺乏信号活性的前结构域[13]。Ⅰ类BMP前体蛋白具有两个高度保守的共切割基序，Ⅱ类BMP前体蛋白只有一个单一的保守切割基序[20]。Ⅱ类BMP前体蛋白被切割于单一的保守位点后，产生一个非共价连接的前结构域/配体复合物[21]。Ⅰ类BMP前体蛋白先在配体结构域附近的S1位点被切割后，BMP配体与前结构域形成一个短暂的非共价复合物；然后在前结构域内靠近配体的S2位点被切割，配体在复合物被破坏后从中释放出来[22]。不同BMP前结构域在调节各自同源二聚体的活性方面起着不同作用，它们虽然缺乏信号活性，但有助于活性配体的二聚、折叠和分泌[20]。Neugebauer等[20]最近发现当BMP-4和BMP-7配体表达于BMP-4前结构域单独存在的情况时，BMP-4/7异源二聚体配体存在高度稳定的表达水平，而同源二聚体中的任意一种均极少被观察到；当BMP-4和BMP-7配体表达于BMP-7前结构域单独存在的情况时，BMP-4/7异源二聚体配体很少存在，而存在高表达水平的BMP-7(而不是BMP-4)同源二聚体。这表明BMP-7前结构域优先驱动BMP-7前体蛋白的同聚，而BMP-4前结构域优先驱动BMP-4和BMP-7前体蛋白的异聚。这一发现可能对如何调节BMP同源二聚体及异源二聚体在体内的相对含量具有重要指导意义。

当BMP-4和BMP-7在非洲爪蟾同一细胞中共同表达时，优先形成BMP-4/7异源二聚体，而不是同源二聚体[23]；而当BMP-2和BMP-7在斑马鱼同一细胞中表达时形成等量的BMP-2/7异源二聚体和相应同源二聚体[24]，这表明异源二聚体和同源二聚体的相对含量可能因种属和细胞类型而存在差异。Kim等基于前期研究[20]提出假设：在特定细胞类型中，某一过量的Ⅱ类BMP形成同源二聚体的同时可形成异源二聚体以补偿其他单一Ⅱ类BMP的缺失[13]。他们设计产生了一种BMP-7R-GFlag基因突变小鼠，BMP-7R-Gflag纯合子表达一种不可切割、不活跃的BMP-7前体蛋白。这种突变消除了BMP-7同源二聚体和所有其他与BMP-7R-Gflag异聚所形成异源二聚体的功能。研究结果显示，BMP-7空白突变纯合子成活，但BMP-7R-GFlag纯合子胚胎致死且有不同程度的表型缺陷，并且广泛地降低了BMP活性，这表明含BMP-7的异源二聚体在早期胚胎发生过程中发挥重要作用，也验证了上述假设。可以说，BMP异源二聚体与同源二聚体在不同组织和不同发育阶段可能存在很大的功能差异。该研究同时表明，在哺乳动物发育过程中，BMP-7主要与BMP-2或BMP-4形成异源二聚体而发挥作用；也解释了为何无论BMP-4抑或BMP-7突变都会导致人类相似的先天性表型缺陷[13]。

2 BMP异源二聚体的信号通路

2.1 BMP异源二聚体受体

BMP信号依赖于分泌释放的配体和靶细胞表面表达的Ⅰ型受体(BMPR-Ⅰ)和Ⅱ型受体(BMPR-Ⅱ)，一个成熟的配体受体复合物需要一个配体二聚体、两个BMPR-Ⅰ和两个BMPR-Ⅱ[25]。BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ是目前唯一已知的一类具有丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶活性的人单向跨膜细胞表面受体，分别有4种和3种亚型[26]。Ser/Thr蛋白激酶受体R3(ALK1)、激活素1型受体(ALK2)、BMPR-1A(ALK3)、BMPR-1B(ALK6)等作为BMPR-Ⅰ；BMPR-2、激活素2A型受体(ACVR-2A)及ACVR-2B等作为BMPR-Ⅱ[27]。

不同的BMP配体对两种受体的亲和力不同(图1)。BMP-2和BMP-4对ALK-3和ALK-6的亲和力高，但对BMPR-Ⅱ的亲和力很低[28]；相反，BMP-6和BMP-7对BMPR-Ⅱ具有高亲和力，而对BMPR-Ⅰ的亲和力中等或低下[29-31]。相较之下，BMP-2/6异源二聚体对BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ都具有很高的亲和力[31]，从而能更快、更稳定地形成配体/受体复合物，更早、更强地激活下游信号通路，包括Smad通路(如Smad1/5/8)及非Smad通路(如ERK、p38等)。Buijs等[32]的研究也表明，BMP-2/7异源二聚体对BMPR的亲和力明显高于其同源二聚体。此外，BMP异源二聚体能促进BMPR的高水平表达，加快BMPR复合物的形成[33]。

图1 不同BMP配体对两种受体亲和力差异示意图Fig.1 Schematic diagram of the difference in affinity of different BMP ligands for two receptors

2.2 BMP异源二聚体Smad通路

BMPs作为配体与受体结合后激活一系列复杂的下游胞内介质，包括经典的Smad通路及其他非Smad通路[34]。Smad通路是成骨细胞和成软骨细胞及其前体细胞所共有的，并在这些细胞中受到严格的调控。有研究发现，BMP-2和BMP-7能轻度促进Smad1/5/8的磷酸化水平；而BMP-2/7异源二聚体可明显增强Smad1/5/8的磷酸化水平；两者均不增加Smad含量[35]。非Smad通路也可能是实现BMP异源二聚体更强的诱导成骨能力的原因之一。Miao等[36]证明BMP-2/7异源二聚体具有刺激大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨的强大能力，且ERK信号通路可能部分增强其成骨效应。Zhang等[37]的研究表明，BMP异源二聚体在不同细胞类型中的效应差异可能与ERK信号通路在不同细胞中发挥不同作用有关。

2.3 BMP异源二聚体胞外拮抗

由于BMP存在胞外循环，某些胞外拮抗剂通过与BMP结合而使BMP无法结合并激活BMPR，包括Noggin、Chordin、Follistatin和Follistatin相关基因(FLRG)、Ventropin、Dan/Cerebus家族(Dan、Gremlin、Caronte、Dante、Sclerostin)及原肠形成蛋白基因(TSG)等[16,38]。

同源二聚体与异源二聚体对胞外拮抗剂的反应有所不同，如Noggin对BMP-2和BMP-7有明显的拮抗作用，而对BMP-2/7异源二聚体没有或仅有轻度拮抗作用[19]。其可能是由于结构对称的Noggin无法高度结合结构不对称的BMP-2/7异源二聚体；还可能部分归因于异源二聚体配体/受体复合物的加速形成，使异源二聚体与Noggin结合减少[39]。与之相反，Chordin对BMP-4/7异源二聚体与BMP-4同源二聚体具有相似的亲和力[23]。但总的来说，许多拮抗剂(如Noggin、CIZ等)对BMP异源二聚体表现出更低的亲和性，从而使BMP异源二聚体的骨诱导效率明显高于BMP同源二聚体[39-40]。

3 BMP异源二聚体诱导成骨研究

3.1 基因治疗

基因治疗可能是骨缺损的可行疗法之一，使用基因载体将生长因子传递至骨缺损部位，靶基因可持续和潜在可调控地诱导产生内源性BMP，从而促进骨愈合。基因载体可分为病毒载体和非病毒载体，近年来人们对非病毒载体给予了更多关注。Loozen等[41]对山羊间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)进行pBMP-2/pBMP-6、pBMP-2/pBMP-7共转染或单独转染，结果表明BMP-2/6及BMP-2/7异源二聚体均具有高效的诱导成骨能力。他们在对大鼠成纤维细胞的研究中也取得一致的实验结果，说明即使转染细胞没有直接成骨潜能，也可以实现体外BMP基因传递，这表明转染细胞主要作为BMP的“工坊”而发挥诱导成骨作用[42]。

非病毒载体虽然具有优异的生物安全性、携带基因量大、制备简单等优点，但低转染率一直限制其被广泛使用[43]。Kaipel等[44]期望利用阳离子聚合物增强pBMP-2/pBMP-7的共转染率，他们将加载pBMP-2/pBMP-7及靶细胞的纤维蛋白基因激活基质(gene-activated matrix，GAM)以添加或不添加阳离子聚合物的方式植入大鼠股骨缺损区，结果显示添加阳离子聚合物的共转染组成骨少于不添加的共转染组，说明阳离子聚合物未能提高反而降低了pBMP-2/pBMP-7的共转染率。

非病毒载体基因转染的物理方法有电穿孔和超声穿孔，它们分别利用电能和机械能在细胞膜中产生瞬时孔隙，从而允许外源DNA进入胞内[45-46]。由于牙周组织中存在多种类型MSCs[47-48]，Kawai等设想通过电穿孔的方式将pCAGGS-BMP-2/7载体转染大鼠牙周组织，促进牙周MSCs向成骨细胞分化，从而诱导牙槽骨再生[49]。实验结果显示，转染5 d后实验组观察到新生牙槽骨再生，7 d后新生骨组织与原有牙槽骨组织连接，且成骨后骨质优于lacZ基因对照组。他们的最新研究结果表明，该法最多可提升3周的牙槽骨再生潜能[50]。相较于需要植骨以修复骨缺损的手术方法而言，BMP-2/7非病毒载体基因转染结合电穿孔相对安全且微创，是一种很有前景的骨缺损修复非手术治疗方案。

与电穿孔相比，超声穿孔更加安全、无创[46]。超声介导的微泡增强基因转染已被证明能促进DNA的胞内转染，且具有高度的生物安全性[51-52]。Nomikou等[53]进一步筛选出生物素化的阳离子微泡是该转染方式中最佳的微泡表面修饰方式。他们在前期已证明超声介导的pBMP-2/pBMP-7共转染优于被动转染的基础上，设计了一种超声介导下，加载pBMP-2/pBMP-7、微泡及靶细胞的GAM[54-55]。体外及裸小鼠体内实验表明其具有优异的诱导成骨能力，且该GAM作为一种可由超声调控的、比较成熟的基因载体系统，为BMP异源二聚体诱导成骨的基因治疗提供了一种新策略。

3.2 种属及细胞类型特异性

BMP在不同种属动物或不同细胞类型中的含量可能是不一样的[20,24]，且在不同组织和不同发育阶段存在很大的功能差异[13]。越来越多研究发现BMP异源二聚体的诱导成骨能力可能因种属及细胞类型而存在差异[56-58]。Zhang等[59-60]发现，BMP-2/7异源二聚体在体内或体外均能显著促进人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells，hADSCs)的成骨分化，但与同源二聚体BMP-2或BMP-7相比，BMP-2/7异源二聚体不具有更强的诱导成骨能力。此外，与小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1相比，BMP-2/7异源二聚体在hADSCs成骨分化过程中也不具有更强的诱导成骨能力，这可能与ERK信号通路在MC3T3-E1和hADSCs中发挥不同作用有关[37]。Betz等[45]研究BMP在大鼠骨骼肌组织中的诱导成骨能力时发现，无论在高剂量还是低剂量时，BMP-2都比BMP-2/6和BMP-2/7异源二聚体具有更高的诱导成骨能力，在较低剂量下能更快诱导肌肉成骨细胞发生；在高剂量下BMP-2/7异源二聚体对肌肉的成骨作用明显强于BMP-2/6异源二聚体。

3.3 剂量-效应依赖关系

先前许多小鼠细胞类型研究[61-64]表明，BMP异源二聚体的成骨过程存在剂量-效应依赖关系。在低剂量时BMP异源二聚体具有更好的诱导成骨能力；在高剂量时因破骨效应增强，且成骨与破骨最大作用效果不具备优势，其诱导成骨能力与相应同源二聚体无明显差异。在Zhang等[59]对hADSCs成骨分化的研究中，BMP-2/7异源二聚体在200 ng/mL时达到最大效应浓度，并未在5～50 ng/mL浓度时观察到成骨，与先前研究结果不符，但是在50～200 ng/mL的浓度区间内呈现浓度依赖性。因此，在一定剂量范围内BMP异源二聚体仍然存在剂量-效应依赖关系，但其起效浓度及最大效应浓度因种属或细胞类型而异。

3.4 ATRA与BMP异源二聚体的联合应用

全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是维生素A的酸性衍生物，能够调控多种组织细胞的增殖分化，在细胞生长发育及代谢方面有广泛的生物学特性[65]。鉴于此，有研究者设想将适宜浓度的ATRA与BMP联合应用以促进成骨，且期望减少BMP的使用剂量。有研究表明，50 ng/mL的BMP-2/7异源二聚体可完全拮抗300 ng/mL的ATRA对成骨细胞分化的抑制作用并促进成骨发生[66]，而ATRA能抑制BMP-2/7异源二聚体诱导的破骨细胞分化及破骨活性，因此联合应用ATRA与BMP异源二聚体有望成为治疗由破骨细胞过度活跃引起的骨丧失疾病的一种新方法[67]。Liu等[68]的研究表明，联合应用ATRA与BMP-2/7异源二聚体较同源二聚体诱导了更高的早期成骨细胞分化和细胞活性，而在诱导晚期成骨细胞分化时并不占优势。沈晨曦等[69]将ATRA与BMPs单独或联合应用于骨髓间充质干细胞(BMSCs)及MC3T3-E1中，比较研究碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)表达效果的差异。研究结果显示，ATRA与BMP-2/7异源二聚体联合应用可显著协同促进BMSCs的ALP表达，而两者联合应用不能协同促进MC3T3-E1细胞ALP活性升高，说明ATRA与BMP-2/7异源二聚体联合应用于不同细胞类型中的成骨效能不一。

3.5 BMP异源二聚体在口腔颌面外科领域的研究

牵张成骨(distraction osteogenesis，DO)能有效重建牙槽骨垂直高度，然而该技术存在成骨时间长的缺点，限制其广泛应用[70]。Ren等[71]设计了一种加载rhBMP-2/7异源二聚体的RADA16水凝胶支架，相比于rhBMP-2组，其在新西兰白兔下颌DO过程中具有更好的诱导成骨能力，但仍有待探索其分子机制及BMP最适浓度等。

在口腔种植临床治疗中，种植体维持长期稳定需要良好的骨结合，同时种植体颈部需形成良好的“袖口”状软组织封闭[72]。对纯钛种植体进行表面改性，同时促使种植体周软硬组织结合是近来口腔种植领域的主要研究方向[73]。Ettelt等[74]利用层层自组装技术，在TiO2表面上事先加载一层链霉亲和素(streptavidin，SA)单分子层，然后再在其上加载静电吸附生物素化肝素(biotinylated heparin，bHP)的成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)，研究结果表明该方式具有最强成纤维细胞增殖效应。此外，在SA单分子层上加载bBMP-2显著增强了成骨细胞的增殖；在SA单分子层上加载bBMP-2/6及bFn显著增强了细胞粘附。基于此，他们设想了一种加载BMP-2/6异源二聚体、纤连蛋白(fibronectin，Fn)及FGF-2的多重生物功能化TiO2表面，以增强成骨细胞及成纤维细胞的选择性增殖和粘附，从而达到种植初期骨整合及早期软组织封闭的效果。

4 展 望

BMP异源二聚体因较同源二聚体具有更高的诱导成骨能力而受到广泛关注。因由不同BMP单体组成，各种BMP异源二聚体在不同生物的各生长阶段及不同细胞类型中可能存在着功能差异，这在一定程度上将限制BMP异源二聚体的研究及应用。目前对于BMP异源二聚体诱导成骨的作用机制尚不十分清楚，仍有待于进一步研究。基因治疗能可持续且可调控地诱导产生内源性BMP异源二聚体，是今后骨缺损修复的一种可行疗法。对于特定的细胞类型(如鼠源细胞)，BMP异源二聚体的诱导成骨效应在一定浓度范围内存在剂量依赖性，且达到某一浓度时能促进破骨发生，因此以最佳效应剂量比联合其他药物协同应用以抑制BMP异源二聚体的破骨发生，最大程度地提升其诱导成骨能力以降低使用剂量，可能也是治疗骨缺损疾病的一种方法。理想的BMP异源二聚体缓释体系能够长时间保持BMP异源二聚体的缓慢释放，且合适的支架材料能提供优异的骨引导性，将是今后研究的热点。