长春花接种丛枝菌根真菌对柑橘黄龙病菌的抑制效果

全达万　李栋　张金莲　宋娟　胡柳　程通　黄京华　陈廷速

摘  要：通过筛选获得具有显著促生和抗病能力的AM真菌菌株，为防治柑橘黄龙病提供理论依据和基础，并探索防治新途径。采用盆栽法，于长春花幼苗期分别接种17株AM真菌进行长春花农艺性状和对柑橘黄龙病的抗病性比较试验，研究不同丛枝菌根真菌菌株对长春花的促生效果及对柑橘黄龙病的抑制效果。结果表明，长春花接种AM真菌后，菌株GZ10、GZ5和JX70能显著促进植株生长，其中接种GZ10的株高和茎径分别比CK增加了23.1%和12.1%，接种GZ5的叶片数比CK增加了12.9%;接种菌株GZ1、BNMJ和PWJ有效提高了长春花对柑橘黄龙病的抗病和耐病能力，其相对防效分別为78.39%、66.87%和69.75%。

关键词：长春花;丛枝菌根真菌;优势菌株;柑桔黄龙病;抗性

中图分类号：S436.66      文献标识码：A

Effects of Inhibition Citrus Huanglongbing on Catharanthus roseus with Different Arbuscular Mycorrhizal Fungi Species

QUAN Dawan1， 4， LI Dong2， ZHANG Jinlian3， 4 *， SONG Juan4， HU Liu2， CHENG Tong3， HUANG Jinghua1 *， CHEN Tingsu4

1. School of Agronomy， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530001， China; 2. Zhejiang Yangshengtang Institute of Natural Medication Coopration， Hangzhou， Zhejiang 310007， China; 3. School of Public Health Care， Xiamen University， Xiamen， Fujian 361102， China; 4. Microbiology Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： To provide fundamental references and better ways of preventing and controlling citrus Huanglongbing （HLB）， a research was conducted to obtain arbuscular mycorrhizal （AM） fungi that possess plant growth-promoting and disease resistance abilities. The experiment utilized the pot culture method， where 17 strains of AM fungi were inoculated into the roots of Catharanthus roseus that were in the seedling stage. The colonization of different AM fungi strains were analyzed to understand how AM fungi simulating the growth and ameliorate citrus HLB infection in C. roseus under greenhouse conditions. During this process， various measurements were taken， and the agronomic characters， rate of colonization， infection intensity， arbuscular abundance， and HLB infection were analyzed. After C. roseus plants were inoculated with AM strains， strains GZ10， GZ5， and JX70 significantly enhanced the growth of C. roseus. Plants inoculated with GZ10 exhibited 23.1% and 12.1% increase in stem height and diameter， while GZ5 increased leaf number by 12.9%， both in respect to CK. Three strains （GZ1， BNMJ， and PWJ） improved disease resistance to citrus HLB， with a relative prevention rate of 78.39% for GZ1， 66.87% for BNMJ， and 69.75% for PWJ. The result proved that AM inoculation could significantly improve the growth of C. roseus and to some extent increase its disease resistance to citrus HLB.

Keywords： Catharanthus roseus; arbuscular mycorrhizal fungi; dominant strain; citrus Huanglongbing; disease resistance

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.016

柑橘黄龙病（citrus Huanglongbing，简称HLB）是世界柑橘生产上极具毁灭性的一种病害[1]，该病的病原菌为韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌，属于根瘤菌科韧皮部杆菌属。柑橘植株感染柑橘黄龙病后，植株会出现叶黄、凋落、根部腐烂等病症，花畸形且易脱落，果实变小、味道也发生改变，发病后几个月至数年后整个植株会枯死。由于柑橘黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus， CaLas）至今未能从感病植物体中分离出来进行人工培养，这也是導致柑橘黄龙病的研究难以做出突破性进展的原因之一[2]。

长春花（Catharanthus roseus）是夹竹桃科长春花属的喜光性植物，具有很高的观赏价值和药用价值[3]。柯穗等[4]的研究表明：柑橘黄龙病菌可以通过寄生植物菟丝子从一株柑橘植株传到另一株柑橘或草本植物长春花上，大约3个月的时间就能在长春花植株上观察到由黄龙病菌引起的黄化症状。长春花具有生长周期短，易栽培，感染黄龙病菌后发病快，症状明显等特点，因此，将其作为研究柑橘黄龙病的模式植物和实验材料[5]。

丛枝菌根（arhuscular mycorrhizae， AM）是广泛分布在自然界中的一类有益微生物，自然界中80%的陆生植物能与其建立共生关系[6]。AM真菌与植物根系形成的共生体能促进植株对营养和水

分的吸收，进而促进植物的生长，提高植物的抗逆性。AM真菌可调节次生代谢物的合成，改善植物根际微环境，对土传病害有一定的抑制效应[7-8]。研究表明，AM真菌能有效降低真菌、线虫、细菌等病原体对植物的为害程度，减少农药的使用[9]，目前已经证实的可有效控制植物土传病害的AM真菌超过30种[10]。

本研究以长春花作为黄龙病的寄主植物，同时利用不同植物来源的AM真菌菌株对其进行接种，观察长春花接种不同AM真菌菌株后黄龙病的发病情况，从而较快地筛选获得具有显著促生和抗病能力的AM真菌菌株，为防治柑橘黄龙病提供理论依据，并探索防治新途径。

1 材料与方法

1.1  材料

长春花种子及带CaLas的长春花由华南农业大学植物保护学院邓晓玲实验室提供。

花盆（盆口直径为15 cm、深度为12.5 cm，多菌灵浸泡后使用）、营养液（Hoagland）、基质（塘泥∶沙=1∶1）。

试验所用的AM真菌菌株由广西农业科学院微生物研究所土壤微生物课题组分离保存，孢子密度均多于10个/g，接入量为20 g/盆。具体菌株及编号如表1所示。

1.2  方法

1.2.1  种苗移栽  在花盆底部垫一张与底部大小一致的纸片，加入1/2已灭菌的基质，选取长势一致、生长健康的长春花苗移栽至花盆内，在其根部附近放入AM真菌菌株20 g，使其与根系充分接触，继续加入基质至花盆的3/4，同时保证基质没过根系，按菌株编号挂上标签。同时设置不接种处理为对照，每个处理种植15盆，共270盆。

盆栽放置于大棚中，大棚内的光照和温度与外界环境一致，定期观察，每2 d适量浇水，每2周施加Hoagland营养液100 mL/盆。

1.2.2  感病处理  将广西农业科学院微生物所温室内感染柑橘黄龙病的长春花的病叶作为嫁接材料，选取8株长春花，待植株长至8～10对叶时，以去顶芽嫁接病叶的方式感染黄龙病，嫁接前植株浇透水，嫁接后立即放入提前搭好的小拱棚中进行保湿管理。嫁接后10 d内将小拱棚严

密封好，使拱棚内的相对湿度保持在90%以上，10 d后将小拱棚打开，适当降低拱棚内的相对湿度，20 d后可将小拱棚撤去，转移至网室内，隔天浇水1次。

1.2.3  感病率统计  嫁接完成后，对各处理进行为期60 d的感病观察，从第1株长春花植株出现柑橘黄龙病症状开始，记录每个处理中感染柑橘黄龙病的植株数量，直到每一批试验材料中出现的感病植株的数量不再增加为止，做好统计，计算其感病率、病情指数及相对防效。长春花植株感染黄龙病级别划分标准见表2。

感病率=感病植株的数量/（嫁接植株的总数量–植株非病死亡数量）×100%

病情指数=∑（各级病株数×相对级别）/（调查总株数×最高级别）×100%

防效指数=（对照病情指数–处理病情指数）/对照病情指数×100%

1.2.4  长春花根系采集  移栽40 d后，采集长春花根系样品，方法如下：每个处理随机选取3盆植株，用剪刀剪下老、嫩、粗、细4种不同的根系，冲洗干净后用50%酒精浸泡保存，用于观察AM真菌侵染情况，记录根系根外菌丝、根内菌丝、泡囊和丛枝数量，计算菌根侵染率，比较不同AM真菌的侵染能力。

1.2.5  根系染色及菌根侵染率测定  根系染色参考廖楠等[11]的方法，略有改动。将根系取出冲洗干净，剪成1 cm长的根段，加20% KOH溶液浸泡根段，90 ℃水浴8 min后冲洗干净。加入碱性H2O2脱色1 h后冲洗干净，加5%醋酸酸化5 min，然后再加入5%墨水醋染液，放入水浴锅中加热30 min。染色完成后倒去染液，冲洗后用清水浸泡12 h以上脱色，镜检观察菌根侵染情况。菌根侵染率的测定参考王幼珊等[12]的方法。

1.2.6  测定指标与方法  移栽25 d后，测量所有幼苗的株高、茎粗和叶片数，每25 d测量1次。125 d后，每个处理选取5株长春花，将植物挖出来冲洗干净晾干后，称量植株的鲜重，随后装进信封中，95 ℃杀青30 min，再在65 ℃中烘干至恒重（约24 h），称量植株的干重。

1.3  数据处理

采用Excel软件和DPS统计软件对实验数据进行整理和分析，置信水平为95%（P<0.05）。

2  结果与分析

2.1  不同AM真菌菌株对长春花根系侵染情况

接种17种外源性AM真菌，长春花幼苗的根系侵染率存在一定差异，部分达显著性差异（表3）。由表3可见，未接种AM真菌的处理组（CK）未观察到菌丝和囊泡结构，根系侵染率均为0。JX126、GZ1和E16-1-32菌株的根系侵染率较高，均超过了30%，说明这3个菌株可与长春花建立良好的共生关系。而JX145、JX165、LC-C58、E26-47、HTJ2-60和LJCK菌株的根系侵染率较低，均低于10%。17种AM真菌对长春花根系的侵染力不同，这说明AM真菌与长春花之间具有一定的偏好性。根外菌丝、根内菌丝、泡囊结构及丛枝结构的染色图像如图1所示。

2.2  不同AM真菌菌株对长春花幼苗生长的影响

在移栽后25、50、75 d分别测量各处理长春花的茎径、株高和叶片数，结果见表4。对比这3个时期中各处理长春花的茎径、株高和叶片数的变化可以发现：接种处理植株茎径，25 d时，所有接种处理植株均高于对照，除JX165、BNMJ、HTJ2-60、LSJ和PWJ菌株外，其他接种处理均显著高于对照;50 d时，除了JX80、JX145、JX165、LC-C58、E26-47和LSJ菌株外，其他处理茎径均显著高于对照;而75 d时，仅GZ10菌株处理茎径显著高于对照，JX80、JX145、JX165、LC-C58、E26-47、HTJ2-60和PWJ菌株处理茎径均低于对照。接种处理植株株高，25 d时，JX126、JX145、GZ10显著高于对照;50 d时，JX126和GZ10显著高于对照;到了75 d，仅GZ10显著高于对照。接种处理植株叶片数，25 d时，所有接种处理植株均高于对照且大部分处理显著高于对照;50 d时，除JX80菌株外其它菌株处理均高于对照且大部分菌株显著高于对照;到了75 d，仅GZ5菌株处理显著高于对照。

综上所述，25 d时接种处理的长春花茎径、株高和叶片数的增长大多都高于CK处理;而在75 d时CK处理与各处理间的差距变小，与CK相比，仅接种GZ10能显著增加长春花的茎径和株高，接种GZ5能显著增加长春花的叶片数。

长春花种植100 d后，称量其干鲜重，结果见表5。与CK相比，施加AM真菌菌株后只有少部分能增加长春花的鲜重和干重，其中JX70能显著增加长春花的鲜重和干重，LSJ和NGJ能显著增加长春花的鲜重。

2.3 长春花接种不同AM真菌对柑橘黄龙病的抑制效果

长春花接种不同AM真菌对柑橘黄龙病的抑制效果见表6，与CK相比，大部分接種AM真菌的长春花能有效延缓黄龙病病情的发展。其中防效最好的AM真菌菌株为GZ1，其发病率为14.29%，病情指数为8.33%，相对防效高达78.39%。BNMJ和PWJ菌株的发病率为28.57%，病情指数分别为12.78%、11.67%，相对防效分别为66.87%、69.75%。这3个菌株的相对防效均显著高于对照。CK与接种GZ1、BNMJ、PWJ和E26-47菌株长春花的黄龙病症状如图2所示。

3  讨论

有研究表明，AM真菌的根外菌丝和根内菌丝相互交错，形成庞大的菌丝网[13]，提高植物对N、P、K、Zn、Fe、Mn、Cu、Ca等矿质元素的吸收，改善宿主植物的营养状况，促进植物生长发育[14-15]。在本研究中，接种AM真菌可以有效增加植物的茎径、株高、叶片数、鲜重和干重，其中施加GZ10可有效增加长春花的茎径和株高，施加GZ5可有效增加长春花的叶片数，施加JX70可有效增加长春花的鲜重和干重，这3种菌株可作为促进长春花生长的优势菌株。不同的AM真菌对同一宿主植物有不同的侵染率，侵染率高的AM真菌说明可与该宿主植物有较强的亲和度[16]，在长春花根系的定殖率中发现，这3种菌株的侵染率不是最高的，侵染率最高的菌株JX126对长春花的促生长作用并不明显，说明该菌株虽然与长春花根系的亲和度较高，但不能有效促进长春花的生长。

AM真菌与宿主植物共生后，会诱导宿主植物产生一些激素类物质，如植保素、几丁质酶、过氧化物酶、β-1，3葡聚糖酶、胼胝质等[17]。张伟珍[18]在接种AM真菌的箭筈豌豆的叶片中检测到POD和CAT活性显著高于未接种处理，说明AM真菌可以提高植物对逆境胁迫的抵抗能力。然而在AM真菌和宿主植物的互作中，并不是所有的AM真菌都能提高植物的抗病能力和耐病能力，有些会出现无效应[19]甚至负效应[20]的结果。在本研究中，感染柑橘黄龙病后，与CK相比，柑橘黄龙病的发生明显受到了抑制，大部分接种了AM真菌的长春花感病率和病情指数皆低于CK，特别是接种GZ1，该处理相对防效高达78.39%，BNMJ和PWJ的防治效果也达到了60%以上。但也有少部分菌株引起了负效应，如JX145和E26-47的感病率和病情指数皆高于CK。目前虽然筛选出一些有预防效果的AM真菌菌株，但其背后的抗病机理尚不明确，还需要在今后做进一步的研究。

4  结论

接种AM真菌后，长春花的茎径、株高、叶片数、鲜重和干重均得到了不同程度的增加，其对柑橘黄龙病的抗病和耐病能力也有所提高。对比接种不同AM真菌对长春花的促生效果，GZ10、GZ5和JX70可选为优势AM真菌;对比接种不同AM真菌提高长春花对感染柑橘黄龙病的抗病与耐病能力，GZ1、BNMJ和PWJ可选为优势AM真菌。

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收稿日期  2019-09-18;修回日期  2019-11-06

基金项目  国家自然科学基金项目（No. 31360356，No. 31760137）;厦门大学联合项目（2017-21）;广西农业科学院科技项目（No. 2015YT81）。

作者简介  全达万（1995—），男，硕士研究生，研究方向：作物生态。*通信作者（Corresponding author）：张金莲（ZHANG Jinlian），E-mail：zhangjinlian1@126.com;黄京华（HUANG Jinghua），E-mail：hjhscau@163.com。