基于表型和SRAP标记的盆栽菊遗传多样性分析

沈瑶　王晗璇　侯海娴　吴智明　周厚高

摘  要：基于20個表型性状和相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）标记技术对30个国外引进盆栽菊品种遗传多样性进行研究。结果表明，参试盆栽菊品种表型变异丰富，性状变异系数为14.67%～ 78.25%，最低和最高变异系数分别为冠幅和舌状小花数。性状主成分分析结果显示，前5个主成分贡献率达76.68%，综合反映了花型大小、叶片形态和花色的重要性。基于表型性状的聚类分析可将30个盆栽菊品种划为3个类群：第Ⅰ类群包含14个品种;第Ⅱ类群包含2个品种;第Ⅲ类群包含14个品种。表型性状的聚类结果与花径和观花期有一定联系。SRAP分析筛选到11对多态性引物，获得1866个多态性位点，多态性比例为92.61%。品种间的遗传相似系数为0.67～0.85，表明30个品种存在一定的遗传变异。基于品种间遗传距离构建的NJ（neighbor joining）进化树结果显示，30个盆栽菊品种可划分为3个类群：第Ⅰ类群包含2个亚群，共17个品种;第Ⅱ类群包含10个品种;第Ⅲ类群包含3个品种。2种分类方法均将研究对象分为3个类群，但这3个类群的品种组成并不一致，推测可能和菊花材料本身复杂的遗传背景与试验选材的局限性有关。

关键词：盆栽菊花;遗传多样性;表型;SRAP标记;聚类分析

中图分类号：S682.1      文献标识码：A

Genetic Diversity Analysis of the Potted Chrysanthemum Based on Phenotype and SRAP Marker

SHEN Yao， WANG Hanxuan， HOU Haixian， WU Zhiming， ZHOU Hougao*

School of Horticulture and Landscape Architecture， Zhongkai University of Agriculture and Engineering， Guangzhou， Guangdong 510225， China

Abstract： In order to better protect chrysanthemum germplasm resources and lay a foundation for hybrid breeding， the genetic diversity of 30 potted chrysanthemum varieties were studied based on 20 morphological and SRAP markers. The results showed that the phenotypic variation of potted chrysanthemum varieties was abundant. The coefficient of variation of characters was ranged from 14.67% to 78.25%， which were crown width and tongue floret number. The results of principal component analysis showed that the contribution rate of the first five principal components was 76.68%， which comprehensively reflected the importance of flower size， leaf shape and flower color. Based on the cluster analysis of phenotypic traits， 30 potted chrysanthemum cultivars could be divided into three groups. GroupⅠ， GroupⅡ and Group Ⅲ consisted of 14， 2 and 14 varieties correspondingly. The clustering results based on phenotypic traits were related to flower diameter and natural florescence period. Based on SRAP marker technology， 11 pairs of polymorphic primers were screened out and a total of 1866 polymorphic loci were obtained， with the polymorphic proportion as high as 92.61%. The genetic similarity coefficient between cultivars was ranged from 0.67 to 0.85， indicating that there were some genetic variations in the 30 cultivars. The samples could be divided into three groups based on the NJ tree. GroupⅠ， Group Ⅱ and Group Ⅲ consisted 17， 10 and 3 varieties correspondingly. However， the clustering results of the two grouping techniques showed that there was no good correlation between the two markers， which might be related to the complex genetic background of chrysanthemum materials and the limitations of experimental selection.

Keywords： potted chrysanthemum; genetic diversity; phenotype; SRAP marker; cluster analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.003

菊花（Chrysanthemum × morifolium Ramat.）起源于中國，花型、花色和株型等千姿百态，品种资源异常丰富。据报道，全世界菊花品种约有20 000～30 000种，中国约有3 000多种[1]。栽培菊花大多为六倍体（2n = 6x = 54）或非整倍体，基因组高度杂合且十分庞大（约12.381～24.802 Gb），遗传背景非常复杂[2]。菊花种质资源的鉴定、保存和评价是生产利用和选育菊花新品种的基础，对菊花品种更新和产业升级具有重要意义。国内外有众多学者先后对菊花种质资源进行了表型性状研究，并对菊花种质资源进行分析和整理，为加快优良种质资源的利用和菊花育种奠定了坚实基础[3-6]。近年来，随着生物技术的快速发展，如RAPD[7-8]、AFLP[9-10]、ISSR[11-12]、SSR[13-15]和SRAP[16-19]等多种分子标记技术也先后应用于菊花种质资源遗传多样性研究中，结果显示菊花在基因型上有丰富的遗传多样性。然而，结合表型性状和SRAP分子标记对盆栽小菊品种进行遗传多样性研究还鲜见报道。

本研究基于表型性状和SRAP分子标记技术，对国外引进的30份盆栽菊花品种资源进行遗传多样性分析，探讨其遗传多样性在形态和DNA水平上的关联，旨在为盆栽菊杂交育种过程中亲缘关系分析、杂交亲本的选配提供一定的参考。

1  材料与方法

1.1  材料

试验材料为课题组从国外引进的30个盆栽小菊品种（表1）。2017年下半年栽植于广州市白云区寮采村白云现代农业示范基地。SRAP引物为Li等[20]公布的通用引物，正/反向引物各8条，共产生64对引物组合。所有引物经荧光标记，供机器读图。

1.2  方法

1.2.1  表型性状的测定  本试验选取14个数量性状（花径、花数、观花期、花梗长、头状花序高度、舌状小花长度、舌状小花宽度、叶长、叶宽、叶数、株高、茎粗、冠幅、节间距）和6个质量性状与多态性状（花色、花心颜色、叶缘裂刻深浅、茎颜色、叶基部形态和抗旱性）共20个表型性状，依据《植物新品种特异性、一致性和稳定性（DUS）测试指南—菊花》（中华人民共和国农业行业标准NY/T 2228?2012）在盛花期对各观赏性状进行观测。每个品种调查10株，每个数量性状测量3次，取平均值。变异系数（CV）=（标准差SD/平均值 ）×100%。

1.2.2  SRAP扩增与引物筛选  采用常规CTAB法提取菊花叶片DNA。SRAP扩增体系总体积为25 μL，其中含模板DNA 2 μL，10×PCR buffer（含MgCl2）2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 18.5 μL。扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5个循环;然后再94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环;最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，保存电泳胶图，由北京鼎国生物技术公司完成。

1.3  数据统计与处理

1.3.1  表型数据的统计分析与作图   数量性状数据直接记录，质量性状数据转换成相应数字代码。具体包括：花色（白色或近白色=1，黄绿色= 2，绿色=3，淡黄色=4，黄色=5，橙色=6，粉红色=7，红色=8，浅紫色=9，紫色=10）;花心颜色（白色=1，绿色=2，黄绿色=3，淡黄色=4，黄色= 5，橙黄色=6，橙色=7，红棕色=8，棕色=9，棕黑=10，紫黑色=11）;叶柄姿态（极向上=1，向上=3，平伸=5，向下=7，下垂=9）;叶基部形态（锐角=1，钝角=2，圆=3，平截=4，心形=5）;叶缘裂刻深浅（浅=3，中=5，深=7）;茎颜色（绿色=1，绿棕色或绿紫色=2，棕色=3，紫色=4）;抗旱性（根据自然环境10 d不浇水后植株叶片的萎蔫程度来评价，抗旱=5，中抗=3，不抗旱=1），将相应数值录入Excel 2010。表型性状的变异分析、主成分分析和基于欧式距离的聚类分析与作图均用SPSS18.0软件完成。

1.3.2  SRAP条带统计分析与作图  利用GENESCAN 3.1软件分析保存的胶图。参照荧光标记Marker（Rox500）大小（70、80、90、100、120、140、160、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、425、450、475、490、500 bp，共25条带）在70～500 bp范围内每2 bp读1次数，共读取216个数（相当于216个位点）。而后通过Binthere 软件将提取的片段大小结果转变为0-1矩阵（有带的记为“1”，无带的记为“0”）。Excel 2010统计总位点数和多态性位点数，计算多态性比率。用MEGA-X软件根据遗传距离进行NJ（neighbor joining）聚类分析和作图。

2  结果与分析

2.1  盆栽菊品种表型性状的多样性分析

对30个盆栽菊品种的20个农艺性状进行了调查统计分析。结果表明，不同盆栽菊品种各农艺性状表现出不同程度的多样性（表2），变异系数为14.67%～78.25%。调查的20个性状中，舌状小花数的变异系数最大，为78.25%;其次为茎颜色，变异系数为61.12%;变异系数在40%以上的性状还有舌状小花长度、抗旱性、叶基部形态、花径和花心颜色等。变异系数小于20%的性状有冠幅（14.67%）和叶缘裂刻深浅（15.14%）。

2.2  表型性状的主成分分析

对30个盆栽菊品种20个表型性状进行主成分分析，提取特征值大于1的前5个主成分，累计贡献率达76.68%（表3）。第1主成分特征值为7.60，贡献率为38.02%，对应的特征向量中花径相关系数最大（0.94），其次为舌状小花长度（0.88）、节间距（0.81）、舌状小花宽度（0.78）等，反映了花序大小等狀况，可认为是花形态因子;第2主成分特征向量绝对值较大的性状为叶宽（0.81）、叶长（0.72），主要反映了叶的性状，可认为是叶形态因子;第3主成分特征值为1.96，贡献率为9.78%，对应的特征向量中相关系数较大的有舌状小花数（0.58）、花心颜色（0.56）和花色（?0.54），可概况为花色因子;第4、5主成分特征向量花梗长（0.54）、花心颜色（0.67）和茎颜色（0.59）等，可以看作花形态因子的补充。这些因子的综合表现主要是盆栽菊的花部，包括花径、舌状小花长和宽、舌状小花数、花色和花心颜色等。

2.3  基于表型性状的聚类分析

将表型性状的原始数据进行标准化处理，采用组间联接进行聚类分析，在欧式距离为17.5可以将30个盆栽菊品种分为3个类群（图1）。

第Ⅰ类群包含2个亚群，共14个品种。其中第1亚群含13个品种：‘西奥（8号）、‘卡斯蒂赫（30号）、‘红粉佳人（13号）、‘粉草莓（3号）、‘马里奥（14号）、‘德里粉（2号）、‘麦克（23号）、‘黄草莓（9号）、‘凯撒（18号）、‘罗宾汉粉（20号）、‘迪迪（24号）、‘威廉（19号）和‘夏之恋（15号）;第2亚群包含1个品种：‘绿色心情（29号）。

第Ⅱ类群包含2个品种：‘罗马里奥粉（1号）和‘红日（5号）。

第Ⅲ类群包含3个亚群，共14个品种。其中第1亚群包含2个品种：‘骄阳多彩（21号）和‘骄阳辉煌（28号）;第2亚群包含6个品种：‘朝阳热情（10号）、‘满天星火红（12号）、‘满天星蓬勃（11号）、‘朝阳繁华（22号）、‘满天星蜜桃（4号）和‘拉米雷斯（6号）;第3亚群包含6个品种：‘满天星白（26号）、‘小乒纯洁（27号）、‘骄阳自由（16号）、‘骄阳卡萨（17号）、‘小行星（7号）和‘小乒糖心（25号）。

根据分类结果，再将表型数据进行分类统计，查找类群与表型的关系。从整体看（表4），第Ⅰ类群花径、舌状小花数、舌状小花长度和宽度、冠幅等性状均值高于其他两个类群;第Ⅱ类群的叶长、叶宽、株高、径粗和节间距等性状的均值高于类群Ⅰ和类群Ⅲ，植株生长势相对较强;第Ⅲ类群花径、花期、花梗长、舌状花序高度、舌状小花长度和宽度、叶长和叶宽、株高、径粗、冠幅、节间距等性状的均值都是3个类群中最小的，且抗旱性表现相对较差，所有性状中仅叶数和叶缘裂刻深浅2个性状均值最大。由此说明，分类结果与表型性状之间有一定的联系。

2.4  SRAP引物筛选及扩增结果多态性分析

从64对引物中筛选出11对能扩增出较多特异性条带、且条带清晰稳定的引物。11对引物对30个盆栽菊品种进行SRAP扩增，共获得2015条清晰可辨读条带，其中1866条具有多态性，多态性比例为92.61%（表5）。

2.5  基于SRAP的聚类分析

30份盆栽菊种质的遗传相似系数变化范围为0.67～0.85，表明30个品种间存在一定的遗传变异。基于30个盆栽菊品种间的遗传距离，采用neighbor joining算法构建了NJ树（图2）。结果表明，30个盆栽菊品种可划分为3个类群：

第Ⅰ类群包含2个亚群，共17个品种。其中第1亚群包含15个品种：‘罗马里奥粉（1号）、‘德里粉（2号）、‘粉草莓（3号）、‘满天星蜜桃（4号）、‘红日（5号）、‘骄阳自由（16号）、‘拉米雷斯（6号）、‘小行星（7号）、‘凯撒（18号）、‘西奥（8号）、‘满天星蓬勃（11号）、‘满天星火红（12号）、‘夏之恋（15号）、‘红粉佳人（13号）、‘马里奥（14号）;第2亚群包含2个品种：‘黄草莓（9号）和‘朝阳热情（10号）。

第Ⅱ类群包含10个品种：‘骄阳多彩（21号）、‘朝阳繁华（22号）、‘骄阳卡萨（17号）、‘满天星白（26号）、‘小乒纯洁（27号）、‘骄阳辉煌（28号）、‘威廉（19号）、‘罗宾汉粉（20号）、‘绿色心情（29号）和‘卡斯蒂赫（30号）。

第Ⅲ类群包含3个品种：‘小乒糖心（25号）、‘麦克（23号）和‘迪迪（24号）。

根据SRAP分类结果，将同一类群中个体的表型数据进行分类统计，查找类群与表型的可能关系（表6）。结果显示，不论是叶长、叶宽、叶数，还是株高、茎粗、节间距和冠幅等，各类群差异不明显。第Ⅰ类群花径稍大，花期稍长，但差异不明显。说明SRAP分类结果与表型性状的相关性较差。

3  讨论

3.1  盆栽菊表型遗传多样性

形态学标记作为传统的分类方法，因其操作简单，非常直观，在园艺植物种质资源的整理与评价及遗传多样性分析中经常用到[21-28]，在菊花上也有不少报道[1， 4， 12， 17， 29-33]。收集整理和积累菊花相关的形态学数据是应用现代生物技术加速菊花种质改良的基础。本研究对30个盆栽菊品种的20个表型性状进行统计，并对获得的信息数据进行数量分类学聚类，结果显示，供试盆栽菊品种在形态学水平上有非常丰富的变异，特别是舌状小花数量、茎颜色等变异系数高。对20个表型性状进行主成分分析，发现花径、舌状小花长度、舌状小花宽度和花期等是影响花部形态的主要因子。基于表型性状的聚类结果按照花径?观花期分类：第I类群平均花径6.66 cm，观花期长（60 d）;第II类群平均花径5.51 cm，观花期中等（55 d）;第III类群平均花径2.75 cm，观花期短（43 d）。花色在聚类结果中的规律不是很明显，研究结果与张冬菊等[34]的报道一致。

3.2  盆栽菊SRAP標记遗传多样性

SRAP标记具有操作简便、重复性好、多态性高、成本相对较低等优势，是目前植物遗传多样性及亲缘关系研究中最常用的分子标记技术之一，在国兰[35]、鸢尾[36-37]、杜鹃花[38]、唐菖蒲[28]、万寿菊[39]及菊花[17-18]等多种观赏园艺植物遗传多样性研究中有相关报道。

本研究利用SRAP标记技术对从国外引进的30个盆栽菊品种进行遗传多样性分析，从64对引物组合中筛选获得11对多态性引物，共扩增得到1866个多态性位点，多态性比例达92.61%，显著高于已报道的利用RAPD标记技术分析菊花遗传多样性的多态性比例（69.00%）[7]，与已报道的利用AFLP标记技术分析遗传多样性的多态性比例（92.80%）[40]和利用ISSR标记技术分析遗传多样性的多态性比例（92.50%）[41]等相当，说明SRAP标记有比较丰富的遗传信息。依据多态性标记位点建立的30个盆栽菊品种NJ树结果显示，30个材料可归为3个类群，但归类的结果与表型性状的聚类分析结果有差异。

3.3  基于表型和SRAP分类方法结果的比较分析

本研究基于表型和SRAP标记技术分别对30个国外引进的盆栽菊品种进行聚类分析，2种分类方法均将研究对象分为3个类群，但是这3个类群的品种组成并不一致。这一结果与很多以往的研究报道一致[21， 28， 42-46]。造成2种分类方法结果不一致的原因是多方面的，首先菊花本身的遗传背景十分复杂，而本研究利用的形态性状不足、分子标记探查到的遗传差异有限，不能全面反映品种的遗传信息。其次，形态标记和分子标记是2种不同形式的标记，分子标记反映的是种质间基因型的差异，而形态标记揭示的是某些功能基因在内部和外部环境的共同作用下表达的差异，即基因与环境互作的结果。表型的表现往往是非常复杂的，即使遗传基础很相似，即DNA水平的差异小，但基因受转录水平、翻译水平的调控机制异常复杂，因此表型常常因基因间的互作或调控呈现复杂多样，这也是许多作物中表型分类与分子标记分类不完全一致的主要原因。

总之，基于表型和分子标记技术分析物种的遗传多样性都是可行且十分必须的。尽管聚类结果可能出现不一致的情况，甚至和传统的分类结果出现很大差异。在今后的研究中，可以将三者或更多的分析方法相结合，综合运用多种评价体系，将更有利于对不同品种的来源、特性进行更为准确地分析，能更好地评价菊花种质的遗传多样性。

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收稿日期  2019-12-24;修回日期  2020-01-27

基金项目  广州市科技计划民生专题项目（No. 201903010053）。

作者简介  沈  瑶（1981—），女，硕士研究生，研究方向：园林植物与观赏园艺。*通信作者（Corresponding author）：周厚高（ZHOU Hougao），E-mail：zhouhougao@163.com。