一株临沧野生灵芝的鉴定与驯化栽培

张焱珍　周会明　白玉英　柴红梅　古广红　赵娅通　田利波　卯明娟

摘  要：從采集于云南临沧的野生灵芝子实体中分离纯化获得纯培养物，编号为YAASM4672，结合形态学与ITS序列分析鉴定其分类学地位，并设计了9种栽培种培养基，测定其栽培特性。结果显示，采集到的菌株YAASM4672为灵芝（Ganoderma lingzhi），其形态特征与分子鉴定结果一致。该菌在2号栽培种配方上，菌丝生长和子实体农艺性状（覆土组优于露地组）表现最好。菌丝体白色，长势浓密，38 d满袋，平均生长速度达（5.891.01） mm/d;菌盖黄色，直径达66.00 mm，平均生长速度最快为（4.141.07） mm/d，与其他配方相比，达到显著（P<0.05）或极显著差异（P<0.01）;菌柄褐黄，其长度、直径分别达到84.00 mm、18.00 mm。驯化的野生灵芝菌株YAASM4672人工栽培最优配方为：78%玉米芯、18%米糠、2%高粱粉、1%石膏粉、1%白砂糖，覆土能促进其子实体的生长发育。

关键词：灵芝;形态学;ITS序列分析;驯化栽培

中图分类号：S567.3+1      文献标识码：A

Identification and Domestication Cultivation of a Wild-type Ganoderma lingzhi Strain from Lincang， Yunnan

ZHANG Yanzhen1，2， ZHOU Huiming1，2， BAI Yuying1， CHAI Hongmei2*， GU Guanghong1， ZHAO Yatong1， TIAN Libo1， MAO Mingjuan1

1. School of Biotechnology and Engineering， West Yunnan University， Lincang， Yunnan 677000， China; 2. Institute of Biotechnology and Germplasmic Resources， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming， Yunnan  650221， China

Abstract： An optimal medium was screened for the cultivation of a wild-type Ganoderma lingzhi， which are the basis of its mass production. In this paper， a strain of YAASM4672 was isolated from a wild mushroom fruiting body of Ganoderma lingzhi， from Lincang， Yunnan. Taxonomic status was identified based on its morphology and ITS sequence analysis， and nine media of culture spawn were designed for the determination of its cultivation characteristics. The result showed that the wild strain of YAASM4672 was G. lingzhi， and the morphological characteristics were consistent with its molecular identification. Formula 2 of culture spawn were the best for the mycelial growth and agronomic characters of fruiting body （soil mulched group was better than the open field group） of strain YAASM4672. Its mycelia colour was white and dense， the time of sackful was 38 d， and the growth rate of mycelia was （5.891.01） mm/d. The pileus was yellow， diameter was 66.00 mm， and average growth rate was （4.141.07） mm/d， which were significantly （P<0.05） or extremely significantly （P<0.01） different compared with other formula. Stipe was brownish yellow， its length and diameter was 84.00 mm and 18.00 mm respectively. In short， the optimal medium for artificial cultivation of strain YAASM4672 was 78% corn cob， 18% rice bran， 2% sorghum flour， 1% gypsum powder， and 1% white granulated sugar. Soil mulched can promote the growth and development of its fruiting body.

Keywords： Ganoderma lingzhi; morphology; ITS sequencing analysis; domestication cultivation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.005

靈芝（Ganoderma lingzhi）隶属于灵芝属（Ganoderma）真菌[1-2]，应用历史悠久，自古以来被誉为名贵的中药材[3]，干燥子实体是其药用正品[4]，因其具有抗肿瘤、降血糖、保肝解毒等药用功效[5-8]，已被开发成多种药品和保健品[9]，成为现代医学研究的热点[10]。目前，有关灵芝的众多研究主要集中于该菌的活性物质提取[11]、药理作用[12-13]、分子生物学与基因工程[14]等方面。近年来，随着人们对灵芝药用价值的逐步深入了解，个人自我保健意识逐渐加强，其产品开发越来越受到重视[15]。我国灵芝种质资源种类有100余种，占全世界种类的1/2[16]，但主栽品种大多引自其他国家，且菌种存在活性退化、产量低、抗杂菌能力弱等严重问题[17]。同时，近年来人们对有限的灵芝野生资源的掠夺性采集及生态环境恶化，导致野生灵芝种源数量日益剧减并濒临灭绝。本研究拟在加强灵芝野生资源保护的基础上，研究不同菌株的亲缘关系，开发适合当地栽培的优良品种，利用本地来源广、成本低的栽培原料，对其进行人工栽培。临沧市作为云南省森林覆盖率最大的地级市之一，有“亚洲恒温城”之美称，适合各种恒温结实菌类的生长，拥有丰富的野生灵芝资源。笔者利用采集的当地野生优良灵芝资源，在形态学与ITS序列分析鉴定的基础上，利用当地广泛的农业废弃物（玉米芯、草坪草、麦秸等）代替木屑，设计9种不同培养料，寻找适合该菌生长的培养基，明确其栽培特性，为该菌推广提供理论参考。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试材料  供试野生菌为2014年7月30日，在云南省临沧市滇西科技师范学院小河边绿化带的草坪枯树桩基部采集到的1株野生幼嫩子实体。

1.1.2  培养基  母种培养基（%）：马铃薯20，葡萄糖2，琼脂1.5;液体培养基（%）：葡萄糖2，蛋白胨0.2，酵母提取粉0.2;原种培养基（%）：小麦粒98，石膏粉2;栽培种培养料（%）配方见表1。上述培养基pH均自然。

1.2  方法

1.2.1  菌种的初步鉴定、分离纯化及培养  对采集到的野生菌子实体依据其形态特征进行初步鉴定，并采用组织分离得到纯培养物，将其编号为YAASM4672。该菌株保存于云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所。

1.2.2  DNA提取及ITS序列分析  采用CTAB法提取菌株YAASM4672菌丝体DNA，用0.8%琼脂糖检测DNA的质量和浓度[18]，通过用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）扩增ITS片段[19-20]，PCR产物交由昆明硕擎生物科技有限公司进行测序，所测得的ITS序列通过NCBI在线BLAST N检索，与GenBank中的ITS基因序列进行同源性比较，并利用ClustalX软件对所得序列进行比对分析，比对结果用Gblocks 0.91b （www.phylogeny.fr/one_task.cgi？task_type=gblocks）在线编辑，设置低的一致性选择。用MEGA 6.06v软件构建ML进化树，选择最适模型kimura 2，1000重复的自展分析[21-22]。

1.2.3  制种及最适栽培种配方筛选  采用食用菌常规制种方法[23]，小麦使用前用开水浸泡10 h，沥水，风干至手抓料后手心潮湿为宜;木屑、玉米芯、发酵料、草坪粉、麦秸拌料前要预湿2 h，其中麦秸剪成1 cm左右的小段，每一配方60袋重复。121 ℃下灭菌90 min，然后室温（20～25 ℃）搁置2 d，再继续121 ℃下灭菌60 min 1次，等料温降至30 ℃左右无菌接种，继续置于室温遮光培养，培养期间，及时检查污染，并测定菌丝萌发时间（d）、生长势等[24]。

1.2.4  农艺性状测定  待菌丝体长满菌袋，袋内培养料表面有白色的原基时，采用覆土和露地（凸畦面荫棚）2种方法[14]进行出菇。待菌盖边缘颜色逐渐加深并与中间的颜色一致时进行子实体的采收，测定菌柄长度（cm）、菌柄直径（cm）、菌盖直径（cm）等农艺性状[20]。

1.3  数据处理

实验数据均由SPSS 17.0软件进行统计分析[25]。

2  结果与分析

2.1  野生菌株YAASM4672子实体形态特征

子实体中等，幼芝菌盖白色，中央稍黄，近圆形，边缘薄，木栓质，直径3.5～5.4 cm，厚0.7～ 0.8 cm;菌肉白色，菌管未形成;菌柄紫褐色，有光泽，侧生，长度5～7 cm，直径1.5～2.7 cm;担孢子未形成，从形态学来看，初步鉴定菌株YAASM4672为灵芝（Ganoderma lingzhi）（图1）。

2.2  基于ITS序列的系统发育分析

CTAB法提取菌株YAASM4672的菌丝体DNA，经PCR扩增获得ITS序列片段（图2），测序完成后，将获得的正反向序列使用DNAStar软件包中的SeqMan进行拼接、编辑获得完整的ITS序列（序列长度661 bp），以多孔菌科的假芝属真菌（Amauroderma calcitum）基因序列为外群，与GenBank中的18个相似性最高的灵芝（G. lingzhi）以及灵芝属（Ganoderma）的其他种ITS基因序列进行同源性比较，利用ClustalX软件对所得序列进行多序列联配分析，并使用MEGA6.06v软件构建ML（Maximum likelihood，最大似然法）进化树（图3）。结合其形态学特征，鉴定菌株YAASM4672为灵芝（G. lingzhi）。

2.3  不同栽培种配方对菌株YAASM4672菌絲生长的影响

从表2可见，菌株YAASM4672在9种设定的栽培种培养基上均能生长，不同配方上的菌丝生长情况存在差异。菌丝体颜色白色或淡黄色、微黄色，除4号与9号配方外，其余配方上菌丝生长浓密。其中在2号配方上，菌丝满袋时间最短（38 d），平均生长速度最快，为（5.89± 1.01） mm/d，除与5号配方不显著外，与其余配方相比表现出显著或极显著差异。

2.4  菌株YAASM4672露地栽培农艺性状

凸畦面荫棚栽培试验结果显示，供试的9种配方上只有2、3、5及6号配方产生了子实体，且不同配方的表现不同。在2号配方上子实体的农艺性状最优，菌盖金橘黄或金黄、直径51.00 mm;菌柄颜色褐红，其长度、直径分别达到65.50、17.00 mm;菌盖平均生长速度最快，达到（3.01±0.17）mm/d，并显著高于5号和6号配方（表3）。出菇52 d的成熟露地栽培子实体见图4。

2.5  菌株YAASM4672覆土栽培农艺性状

覆土栽培组试验发现，供试的9种配方上只有配方1、4及9号未出芝，不同配方其栽培特性存在一定差异。在2号配方上子实体的农艺性状最优，菌盖黄色、直径66.00 mm;菌柄颜色褐黄，其长度、直径分别达到84.00、18.00 mm;菌盖平均生长速度最快，达到（4.14±1.07）mm/d，与其他配方相比表现出显著或极显著差异（表4）。出菇62 d的成熟覆土栽培子实体见图5。

3  讨论

野生灵芝多生长于阔叶树的树桩、枯木和倒木上[26]，人工栽培时常以木质素含量较高的木材为主[27]。按照生态保护的要求木材栽培食用菌受到一定的限制，开发新型的栽培原料成为发展木腐食用菌的一种趋势[28]，农业废弃物成为众多原料的首选。

本研究利用临沧市优良的野生灵芝菌株YAASM4672为材料，筛选适合本地灵芝的栽培基质，培养和出菇试验表明该菌在2号培养基上，菌丝体白色，长势浓密，满袋时间最短（38 d），平均生长速度最快，达（5.891.01）mm/d，2号培养基出菇表现也最优，覆土栽培优于露地栽培方式。因此，同一灵芝品种不同栽培方式和栽培基质对灵芝的品质有着很大的影响[29]。覆土能促进菌株YAASM4672子实体的生长发育，玉米芯可作为替代木屑种植该菌的最佳农业废弃物，这与玉米芯中的糖类和蛋白类物质含量及胞外酶活力高于棉籽壳和杂木屑密不可分[30]。为更好地开发与利用该菌株，在今后对该菌株的研究中，以临沧当地的丰富林业资源为突破口，有必要以市场已推广的人工灵芝（如‘信州2号‘台芝1号‘赤芝109号等）为对照，扩展该菌的栽培方式（如开展林下仿生栽培），缩小该菌的研究误差（如不同配方设定相同的酸碱度、C/N比、松紧度等），扩大最适培养料的筛选范围等。

总之，我国是世界灵芝的物种多样性中心[31]，云南是其野生种质资源最多的地区之一，在保护好生态环境的前提下，鉴定和驯化临沧市当地资源，以本地极为丰富的玉米芯为栽培主料，利用适宜的气候条件，大力生产灵芝，既可提高农业废弃物的利用率，增加农民收入，又能促进当地的生态恢复以及经济可持续发展。

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收稿日期  2019-11-28;修回日期  2019-12-27

基金项目  云南省教育厅科学研究基金项目（No. 2019J0491）;国家食用菌产业技术体系项目（No. CARS-20）。

作者简介  张焱珍（1986—），女，硕士，讲师，研究方向：食用菌驯化、栽培及产品开发。*通信作者（Corresponding author）：柴红梅（CHAI Hongmei），E-mail：chm621@aliyun.com。