苗期甘蔗氮高效基因型评价指标的筛选

杨柳　廖芬　MuhammadANAS　李强　彭李顺　黄东亮　李杨瑞

摘  要：本研究通過低氮压力选择，筛选出甘蔗氮高效种质，分析影响甘蔗氮高效的重要指标，为甘蔗氮高效育种及栽培提供理论依据。以58份甘蔗种质资源为材料，在苗期采用正常供氮（2 mmol/L N）和低氮（0.2 mmol/L N）处理，分析甘蔗植株形态、干重及氮素在各器官中累积分配的特征。通过主成分分析方法筛选影响甘蔗氮高效利用的重要指标，通过聚类分析对58份种质进行聚类。结果表明，低氮（0.2 mmol/L N）处理可以明显从植物形态区分不同种质的氮利用差异，58份种质低氮条件下的干重范围为0.64～14.75 g/株，氮累积量为5.53～63.00 mg/株，氮利用率范围为115.40～279.30 g/g。对低氮压力下甘蔗干重及氮累积等25个指标进行主成分分析后，提取出4个主要成分，总贡献率为92.35%。通过高、低氮条件下与氮利用效率有关的氮转移系数及基因潜力等19个指标分析后提取出5个主成分，总贡献率为82.21%。影响甘蔗氮高效的重要指标有甘蔗的干重（全株、叶、根）、氮累积量（全株、叶、茎）、氮利用率（全株、叶）、叶的相对氮利用率、茎的基因潜力、茎的相对干物质量和茎的相对氮累积量。经聚类分析后初步将58份甘蔗种质分为氮高效基因型、偏氮高效基因型、偏氮低效基因型和氮低效基因型。

关键词：甘蔗;种质;苗期;氮高效;筛选指标

中图分类号：S566.1      文献标识码：A

Screening of Sugarcane with High Nitrogen Efficiency at Seedling Stage

YANG Liu1， LIAO Fen1*， Muhammad ANAS2， LI Qiang2， PENG Lishun3， HUANG Dongliang1， LI Yangrui1*

1. Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences / Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement / Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement （Guangxi）， Ministry of Agriculture & Rural affairs， Nanning， Guangxi 530007， China; 2. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China; 3. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： The purpose of the experiment is to screen high nitrogen use efficiency （NUE） genotypes under a low nitrogen pressure selection system. Furthermore， the important indexes which affecting the NUE of sugarcane were analyzed. The results could provided a theoretical basis for the high NUE breeding and cultivation of sugarcane. In the study， seedlings of 58 sugarcane genotypes were evaluated in a hydroponic experiment with low-N （0.2 mmol/L N） and normal-N （2 mmol/L N） treatment. The growth， dry biomass and N cumulative and distribution characteristic in various organs were evaluated according to descriptive statistic， principal component analysis and cluster analysis. The results indicated that morphology， biomass， nitrogen efficiency traits showed high genotypic variation for N treatments. Under low-N treatment， the dry biomass of 58 genotypes varied from 0.64 to 14.75 g/plant， nitrogen accumulation was from 5.53 to 63.00 mg/plant and NUE was from 115.40 to 279.30 g/g. Four factors were extracted with variance contribution approximated to 92.35%， according to 25 parameters such as dry biomass and N uptake with N deficiency. And another five factors were extracted with variance contribution approximated to 82.21%， according to 19 parameters under both normal and low N treatment such as nitrogen transfer coefficient， genetic potential. The data revealed that dry biomass （whole plant， leaf， root）， N uptake （whole plant， leaf， shoot）， NUE （whole plant， leaf）， leaf relative NUE， shoot relative dry weight， shoot relative N uptake， shoot genetic potential were the key factors that involved in sugarcane high NUE. 58 sugarcane genotypes were clustered into four group： high NUE group， slightly higher NUE group， slightly lower NUE group and low group.

2  结果与分析

2.1  不同氮水平对甘蔗苗期生长的影响

在正常供氮条件下，各甘蔗种质生长茂盛，叶色浓绿，枯叶极少出现（图1A）;低氮压力筛选条件下，各甘蔗种质很快表现出生长缓慢，植株普遍小于正常供氮条件下，下部叶多出现黄化，随时间的推移，上部绿叶也出现脉间黄化等缺氮症状（图1B）。不同种质对低氮胁迫反应在表型上存在较大的差异，主要表现为植株的大小、绿叶数量及下部叶片黄化程度的差异。说明以0.2 mmol/L的氮作为甘蔗低氮胁迫的压力是可靠的，在这一压力水平下，各甘蔗种质表现了缺氮症状，且生长势又表现出明显差异，同时也说明甘蔗苗期的表型性状可以作为甘蔗氮高低效种质筛选指标之一。

2.2  不同氮水平下甘蔗氮利用各指标间的变异分析

甘蔗低氮条件下测定及计算后所得各指标数据见表2，与氮利用效率有关的各指标数据见表3，从表2和表3可见，甘蔗各性状指标之间相差非常大，表现出不同程度的变异，甘蔗干重、氮累积、氮利用效率等25个指标的变异系数为18.70%～58.83%（表2），甘蔗氮转运系数、基因潜力、相对干物质重量、相对氮利用率等19个指标的变异系数为7.35%～182.63%（表3）。甘蔗叶、茎、根及总体的干重及氮累积的变异系数较大（40.33%～58.83%），甘蔗低氮条件下氮转运系数及茎的基因潜力、相对干生物重、相对氮累积量的变异系数均在90%以上，说明这些指标灵敏度较高，可以作为不同基因型甘蔗氮高效的筛选指标。

2.3  甘蔗苗期氮高效种质评价指标的筛选

利用主成分分析法，对低氮压力下甘蔗干重及氮累积等25个指标（表2）和与氮利用效率有关的氮转移系数及基因潜力等19个指标（表3）进行提取，获得结果见表4。从表4可见，在低氮压力下甘蔗的25个指标中提取了4个主要成分，其累积贡献率达到92.354%，其中第1成分贡献率为55.50%，指向的性状指标主要是总干重（TDW）、总氮积量（TNuptake）、叶和根干重（LDW和RDW）、叶和茎的氮累积量（Nuptake）、茎的偏肥生产力（PFP）和氮吸收效率（UpE），这些指标在第1主成分中的荷占比均达到90%以上;成分2贡献率为17.465%，指向的指标主要是总氮利用率（TiNUE）和叶的氮利用率（LiNUE），荷占比分别为95.3%和90.0%;成分3贡献率为14.26%，指向的指标主要是根偏肥生产力（RPFP，荷占比89.8%）以及根的氮吸收效率（RUpE，荷占比86.9%）;成分4贡献率为5.129%，指向的指标主要是叶偏肥生产力（LPFP，荷占比61.0%）。在低氮压力选择下，第1主成分和第2主成分贡献率最大，累积达到72.965%，其中在成分荷载矩阵中占比最重要的是总干重、总氮累积量、叶和根干重、叶和茎的氮累积量、茎的偏肥生产力、氮吸收效率、总氮利用率和叶的氮利用率，这几个指标在第1和第2成分主成分中的荷载超过90%以上，说明这几个指标最能代表不同基因型甘蔗对氮素的响应状况。

同时考虑低氮和正常氮條件下各指标时，从与氮效率相关19个指标中提取5个主要成分，累积贡献率达到82.213%，其中第1成分贡献率为25.511%，指向的性状指标主要是叶和根的相对氮利用率、低氮条件下总氮转运系数，荷占比分别为93.1%和86.3%;成分2贡献率为21.508%，指向的性状指标主要是总基因潜力、茎的基因潜力、茎相对干物质重、茎相对氮累积，荷占比分别为75.2%、95.5%、97.1%和94.5%;成分3贡献率为16.58%，指向的性状指标主要是总相对地上部地下部干重比、根基因潜力、根相对氮累积、根相对干物质重，荷占比分别为80.1%、90.7%、90.7%和82.8%;成分4贡献率为11.354%，指向的性状指标主要是叶基因潜力、叶相对氮累积、叶相对干物质重，荷占比分别为83.0%、83.1%和82.8%;成分5贡献率为7.26%，指向的性状指标主要是茎相对氮利用率，荷占比为80.7%。有文献[21]报道，只有在低氮和正常氮或是高氮条件下均可以保持较高的氮利用率的材料，才是典型的氮高效材料，因此，筛选评价指标的时候，应该也考虑低氮和正常氮下的各指标，进行综合评价。在同时考虑低氮和正常氮条件下提取的5个主成分中，以第1和第2主成分的贡献率较高，它们所指向的指标中，叶的相对氮利用率、茎的基因潜力、茎相对干物质重、茎相对氮累积荷占比在90%以上，说明这些指标能反应甘蔗在低氮和正常氮条件下的氮利用状况。

在实际操作中，干重和氮累积量的指标测定易于操作，叶取样更方便、快速，因此，全株的总干重、总氮累积量、总的氮利用率、叶的干重、叶氮累积量、叶氮利用率、叶的相对氮利用率作为评价指标会更方便快速，而主成分分析的结果也表明这几个指标的贡献率和荷占比均较高，适合作为甘蔗氮高效的评价指标。

2.4  不同氮利用效率甘蔗种质的聚类分析

为更好的评价不同种质的氮利用效率，根据主成分分析结果，以在第1主成分和第2主成分中占权重较大的甘蔗总干重、总氮累积、总氮利用率、叶的相对氮利用率等4个指标作为聚类的主要指标，采用平方欧式距离法对58份甘蔗基因型进行聚类分析（图2，表5），根据聚类分析结果，发现58份种质分成了4个主要类群，进一步分析了这4个类群的总干重、总氮累积、总氮利用率、叶的相对氮利用率等的数据之后（表5），发现4个类群的各指标之间存在显著差异，根据各类群氮利用率将58份甘蔗基因型分成4类，氮高效基因型（Ⅰ型）、偏氮高效基因型（Ⅱ型）、偏氮低效基因型（Ⅲ型）和氮低效基因型（Ⅳ型）。氮高效基因型有Co1149、CC92-85、CP02-1143等19份种质，占所有种质数量的32.77%;偏氮高效基因型有RB88-5054、Q202、GT37等10份种质，占所有种质数量的12.24%;偏氮低效基因型有GT29、GT31、RB92-2579等12份种质，占所有种质数量的20.69%;氮低效基因型有GT11、YaCheng96-40、GXS79-9等17份种质，占所有种质数量的29.31%。

从表5看，Ⅰ型～Ⅳ型之间的氮利用效率平均值分别为221、189、159、153 g/g，氮高效基因型材料的氮利用率显著高于氮低效基因型材料。不同类型种质之间的干重、茎PFP和叶氮利用率也存在明显差异，氮利用率高的种质，干重、茎PFP和叶片氮利用率也相应明显较高。而叶的相对氮利用效率正好相反，说明氮高效的种质材料叶的氮利用率在正常供氮时，可以保持很好的氮利用率，氮低效的种质材料在正常供氮的条件下叶片的氮利用效率较低。

3  讨论

作物氮高效种质筛选是氮高效品种选育以及获得典型种质的前提条件，作物产量，外观形态，根、茎、叶等器官生物量及氮累积量等指标均与氮利用效率相关，主成分分析法和聚类分析法相结合，筛选影响作物氮利用效率的关键指标，在苦荞[22]、烟草[15]、花生[13]等作物上得到了验证，这些研究为甘蔗氮利用指标的筛选提供了参考。

在本研究中，与甘蔗氮利用相关的指标共有44项，这些指标分别反映了甘蔗全株和根、茎、叶各器官在低氮条件下生长的氮利用以及在高、低氮条件下氮利用潜力等特征，通过主成分分析之后，确定了不同指标对甘蔗氮利用的影响程度如下：在低氮条件下，茎氮累积量、根干重、总氮累积、茎氮吸收效率、茎PFP、叶干重、总干重、叶氮累积>总氮利用率、叶氮利用率>根的PFP、根的UpE;结合高低氮条件共同分析，各指标对甘蔗氮利用的重要关系如下：叶的相对氮利用率>茎的相对干物质重、茎的基因潜力、茎的氮累积量>根的基因潜力、根的相对干物质量>叶的相对干物质重、叶的基因潜力、叶的氮累积量>茎的相对氮利用率，这些指标的总贡献率在72%以上，可见这几个指标对甘蔗氮利用有非常重要的影响。本研究结果与前人的相似，前人的研究表明玉米的生物量[23-24]、完熟期时的全株干重、吐丝期时的穗三叶氮含量、花前氮的累积量[25]可作为玉米氮高效筛选的重要指标。Krishna等[26]的研究表明，水稻叶、茎、根的生物量及根长是评价水稻氮高效的重要指标。小麦的耐低氮指标也主要指向茎、叶的相对干重、相对吸氮量和干重[27-28]。在本研究中，以第1、第2成分主成分中荷载比较大的干重、氮累积量、氮利用率及叶片相对氮利用率为主要指标，进行聚类分析后，发现58份甘蔗种质可以明显分为4个类群，且4个类群的氮利用率、干重和氮累积量也有显著差异（表5），说明主成分分析及聚类分析确实可以较好筛选影响甘蔗氮高效的重要指标，并且可以较好地将不同种质进行分类。

在本研究中，选用了2类指标进行主成分分析，以低氮试验下的25个指标进行主成分分析时，提取到4个主成分的累积贡献率达到92.35%，而以正常、低氮条件均考虑的19个指标进行主成分提取时，提取到的5个主成分的累积贡献率仅为82.21%，可见低氮试验的各指标作为甘蔗氮高效的评价指标会更适合。甘蔗收获的主要是营养体——茎秆，与谷类作物小麦、水稻、玉米等以收获籽粒为主的作物不同，本研究选用的甘蔗材料为生长138 d的苗期材料，甘蔗已经开始拔节，此时甘蔗吸收的氮素營养会占到全生育期的一半左右[29]，因此以该生长期的甘蔗为材料可以反映评价甘蔗氮利用状况。

本研究结果表明甘蔗的生长形态、干重、氮累积、氮利用效率等可以作为甘蔗氮高效的筛选指标，本研究仅是在室内盆栽进行了试验，今后仍需在大田条件下进行田间实验以进一步验证室内试验的结果。在本研究中将58份种质分成了4类不同氮利用效率类型，但也发现氮利用率最高的种质与最低的种质只相差2倍左右，今后还需要进一步扩大筛选种质的范围，以期找到氮利用效率更高的种质。此外，对筛选出来的氮利用较高的几份种质，下一步需进行其氮吸收特征的研究，以期能更深入了解甘蔗氮高效利用的可能机制，为甘蔗的栽培及氮高效种质选育提供参考。

致  谢  特别感谢广西甘蔗种质资源圃段维兴在种质材料提供方面给予的帮助。

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收稿日期  2018-11-29;修回日期  2019-05-08

基金项目  国家自然科学基金项目“甘蔗氮高效基因型种质资源筛选及其高效机制研究”（No. 31601249）;广西农业科学院基本业务经费项目（No. GNK 2019M20）;热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室开放课题“甘蔗氮高效基因型种质筛选”项目（No. 1630032017020-7）。

作者简介  杨  柳（1983—），男，博士，副研究员，研究方向：甘蔗氮素高效利用。*通信作者（Corresponding author）：李扬瑞（LI Yangrui），E-mail：liyr5745@126.com;廖  芬（LIAO Fen），E-mail：liaofen@gxaas.net。