浸泡时间对金银花7种成分水提效果的影响

刘田园，丁惠，陈衍男，赵恒强，王晓，王明林，崔莉，*

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东济南250014；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271018；3.山东中医药大学药学院，山东济南250355）

金银花又名二花、双花等[1]，是忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初开的花，其主要成分包括有机酸类、黄酮类、环烯醚萜类、三萜皂苷类、糖类等[2-3]。金银花药用历史悠久，几千年来用于中医治疗传染病以及温病发热、痈肿疔疮、咽喉肿痛等症[4-5]，更是传统的药食两用中药材，广泛应用于食品领域[6]。金银花工业化提取的核心是煎煮加热，绿原酸等有机酸类成分是金银花清热解毒功效的重要药理学基础[7]，以金银花水提液为基础开发的功能饮料不仅能够清热降火、消暑解渴，还具有一定的利胆保肝、降低血脂、增强免疫力等保健作用[8-9]。

目前金银花提取的研究以醇提取物为主[10]，水提物及提取过程研究相对较少。段晓颖[11]采用正交试验法以绿原酸为指标优选出了金银花的最佳水提工艺；许哲等[12]以绿原酸为指标对金银花的传统水煎法、乙醇回流法、动态温浸法、超声提取法、乙醇渗漉法等各种工艺进行了比较研究；尚丽霞等[13]采用高效液相色谱法研究了不同提取工艺、不同提取时间、不同浓缩干燥方法对绿原酸含量的影响；余杰等[14]考察了加水量、煎煮温度、煎煮时间对绿原酸提取率的影响；王盈峰等[15]通过正交试验，综合水浸出物、氨基酸、黄酮和绿原酸含量4 项指标得到金银花的最适浸提条件。相关研究主要集中在工艺优化，而水提工艺中的浸提时间的选择尚未见系统研究报道，而且目前相关研究主要以绿原酸为单一质量指标，金银花中有机酸成分主要是绿原酸类化合物，迄今已分离出40 多种，虽然绿原酸是其中主要的成分，但金银花的内在质量并不是靠单一成分所决定的，而是多种成分相结合，并同时起作用才可达到预期效果[16]，金银花浸提水提过程中多种有机酸成分的变化规律亟待研究，因此本文采用多指标评价的方法研究浸泡时间对金银花中多种有机酸类成分水提效果的影响，以期为金银花加工生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

金银花：山东宏济堂医药有限公司中药厂；乙腈（色谱纯）：美国Tedia 公司；甲酸（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司；绿原酸对照品（纯度＞98%）：成都德思特生物技术有限公司；异绿原酸A/B/C 对照品、异绿原酸、隐绿原酸对照品、獐牙菜苷对照品（纯度均＞98%）：上海同田生物技术股份有限公司。

1.1.2 仪器与设备

电子天平（BSA2202S-CW）：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DFD-700 仪表恒温水浴锅：上海树立仪器仪表有限公司；高效液相色谱仪（S6000）：华谱新创科技有限公司；YMC-Pack ODS-A 色谱柱（250×4.6 mml.D.，S-5 μm，12 nm）：日本 YMC 公司；针筒式滤膜过滤器：天津市津腾实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 浸泡时间对水提效果影响的考察

热水浸提，以1 ∶30 质量比进行试验，设置不同的浸泡时间（0、30、60、90 min），分别采用 80、95 ℃提取，提取总时长为120 min，各3 组平行试验。每间隔15 min取 1 mL 提取液，冻干，甲醇复溶，过 0.45 μm 滤膜注入液相色谱进样瓶待测。

1.2.2 金银花水提液中成分分析

采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）检测水提液中主要有机酸类成分，色谱条件：流速 0.3 mL/min，进样量 5 μL，检测波长254 nm，流动相为：A 乙腈（1.0%甲酸），B 水（1.0%甲酸），梯度洗脱：0～5 min，10%～17%A；5 min～30 min，17 %～22 %A；30 min～40 min，22 %～35 %A；40 min～45 min，35%～40%A；45 min～60 min，40%A。

标准曲线的建立：用无水甲醇准确配制浓度为1.00 mg/mL 的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、獐牙菜苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 标准溶液，各取200 μL 混合，按上述色谱条件进样 1、5、10、15、20 μL，测定峰面积，绘制标准曲线。新绿原酸：y=394.92x-40.564，R2=0.999 1；绿原酸：y = 501.99x-311.37，R2=0.999 2；隐绿原酸：y=504.63x-176.01，R2=0.999 4；獐牙菜苷：y=603.29x-284.05，R2=0.999 2；异绿原酸 B：y=618.31x-445.99，R2=0.999 2；异绿原酸 A：y=611.15x-139.42，R2=0.999 1；异绿原酸 C：y=672.35x-342.59，R2=0.999 3。R2均大于0.999，线性良好。

2 结果与讨论

2.1 HPLC分析

建立金银花水提液中7 种成分的HPLC 检测方法，见图1。

图1 金银花提取液和7 种化合物混标的HPLC 图Fig.1 HPLC diagram of the mixed extract of Lonicera japonica Thunb.water extract and seven compounds

通过HPLC 标准品比对7 种化合物分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、獐牙菜苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C，同时采用高效液相色谱-质谱联用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）进行定性确认，通过标准曲线进行定量。

2.2 金银花水提液中有机酸类成分的变化规律

2.2.1 新绿原酸

新绿原酸的提取效果如图2 所示。

图2 新绿原酸在不同温度下提取量变化图Fig.2 Change of extraction amount of new chlorogenic acid at different temperature

在80 ℃和95 ℃提取时，4 种条件下水提液中新绿原酸含量均呈上升趋势，且直接提取＞浸泡30 min＞浸泡90 min＞浸泡60 min，直接提取的效果明显优于常温（20 ℃左右）浸泡，特别是95 ℃提取时，不浸泡直接提取时新绿原酸溶出速度快、提取量大，所得的水提液中的新绿原酸含量最高。80 ℃提取时整个提取时段中90 min～120 min 内新绿原酸含量相对稳定。与80 ℃条件相比，95 ℃下各组间提取效果差异更明显，新绿原酸在95 ℃下提取效果比80 ℃效果好，其中95 ℃直接提取得到的新绿原酸含量最高，在浸泡90 min 后提取时，均在105 min 后出现含量下降的趋势。

2.2.2 绿原酸

绿原酸是金银花最主要的有机酸成分，在检测的7 种有机酸中含量最高，结果见图3。

图3 绿原酸在不同温度下提取量变化图Fig.3 Change of extraction amount of chlorogenic acid at different temperature

80 ℃提取时绿原酸提取量：浸泡30 min＞浸泡60 min＞直接提取＞浸泡90min，常温浸泡30 min 时提取60 min 后绿原酸溶出速率降低。95 ℃提取时绿原酸提取量：浸泡30 min＞浸泡60 min＞浸泡90 min＞直接提取，75 min 以后各组提取量均增速变缓。80 ℃和95 ℃下均在浸泡30 min 后提取效果最好好，提取45 min 时的提取量均高于直接浸提105 min 时的提取量，其中浸泡30 min 后95 ℃提取得到的绿原酸含量最高。在浸泡时间达到90 min 后，均在浸提105 min 后出现绿原酸含量下降。总体来看绿原酸在95 ℃下提取效果比80 ℃提取效果稍好。

2.2.3 隐绿原酸

隐绿原酸提取量的变化规律与新绿原酸相似，但其含量较新绿原酸低，结果见图4。

图4 隐绿原酸在不同温度下提取量变化图Fig.4 Change of extraction amount of cryptochlorogenic acid at different temperature

80 ℃和95 ℃提取时隐绿原酸含量均为：直接提取＞浸泡30 min＞浸泡90 min＞浸泡60 min，随着提取时间的延长，水提液中隐绿原酸的含量总体呈上升趋势。隐绿原酸在95 ℃下提取效果比80 ℃效果好，直接提取组的隐绿原酸溶出速度快、提取量大，所得的水提液中的隐绿原酸含量最高。与绿原酸类似，在浸泡90 min 后浸提时，在提取105 min 后隐绿原酸含量也出现下降。

2.2.4 獐牙菜苷

獐牙菜苷是一种环烯醚萜类化合物，具有良好的抗炎效果[17]，其提取效果见图5。

80 ℃提取时提取量：浸泡90 min＞浸泡60 min＞浸泡30min＞直接提取，其中直接浸提和浸泡30min 后提取效果相近，在45 min 后提取量变化趋缓。95 ℃提取时：浸泡90 min＞浸泡60 min＞直接提取＞浸泡30min。浸泡60 min、90 min 后，随提取时间的延长，獐牙菜苷含量在80 ℃提取时比95 ℃时增加更快，且最终提取量更高，浸泡90 min 后95 ℃提取时獐牙菜苷含量持续较高且相对稳定。浸泡90 min 后，两个温度下浸提105 min 时獐牙菜苷含量都出现下降。

图5 獐牙菜苷在不同温度下提取量变化图Fig.5 Change of extraction amount of sweroside at different temperature

2.2.5 异绿原酸B

异绿原酸B 在两个提取温度下总体变化规律类似，结果见图6。

随提取时间的延长，均呈现逐渐增加的趋势，在60 min 前增加迅速，之后含量的增加减缓，趋于平稳，浸泡时间对提取量的影响差别较小。95 ℃直接提取时异绿原酸B 含量呈现明显的先增加后减小的趋势，与其他3 组差异明显，在浸泡90 min 的两个提取温度下，均在105 min 后出现含量下降现象。

图6 异绿原酸B 在不同温度下提取量变化图Fig.6 Change of extraction amount of isochlorogenic acid B at different temperature

2.2.6 异绿原酸A

异绿原酸A 的提取量总体呈现先增加后减小的趋势见图7。

图7 异绿原酸A 在不同温度下提取量变化图Fig.7 Change of extraction amount of isochlorogenic acid A at different temperature

随着浸泡时间延长，提取量减少，浸泡60 min 和浸泡90 min 差异不明显，即直接提取＞浸泡30 min＞浸泡90 min 和浸泡60 min。80 ℃浸提时，提取45 min～60 min 后异绿原酸A 含量开始下降，95 ℃浸提时，随提取时间的延长，异绿原酸A 含量的降低速率较80 ℃浸提时更快。80 ℃直接提取，45 min 时提取量最高。

2.2.7 异绿原酸C

浸泡时间对异绿原酸C 提取量的影响差别显著，结果见图8。

图8 异绿原酸C 在不同温度下提取量变化图Fig.8 Change of extraction amount of isochlorogenic acid C at different temperature

直接提取＞浸泡 30 min ＞浸泡 90 min 和浸泡60 min，随提取时间延长，各组均呈现缓慢稳态上升的趋势，95 ℃直接提取时含量显著优于其他各条件，异绿原酸C 在水提液中的含量：95 ℃直接提取＞浸泡30 min，95 ℃提取＞80 ℃直接提取＞浸泡 90 min，95 ℃提取＞浸泡 60 min，95 ℃提取＞浸泡 30 min，80 ℃提取＞浸泡 60 min，80 ℃提取＞浸泡 90 min，80 ℃提取。在浸泡90 min 后提取105 min 时出现含量下降。

2.2.8 7 种有机酸类成分总提取量

对7 中有机酸类成分的总提取量进行比较，结果见图9。

80 ℃时提取量：直接提取＞浸泡30 min＞浸泡60 min＞浸泡 90 min；95 ℃时：直接提取＞浸泡 30 min＞浸泡90 min＞浸泡60 min。综合比较来看，直接95 ℃提取＞浸泡30 min 95 ℃提取＞直接80 ℃提取＞浸泡30 min 80 ℃提取＞浸泡 90 min 95 ℃提取＞浸泡 60 min 95 ℃提取＞浸泡60 min 80 ℃提取＞浸泡90 min 80 ℃提取。

图9 7 种化合物在不同温度下总提取量变化图Fig.9 Total extraction amount of 7 compounds at different temperature

2.3 讨论

浸泡时间对提取过程中多种有机酸类成分的影响存在差异，随着浸泡时间的延长，提取量也存在或增或减的不同情况。加水浸泡能让药材原本干燥萎缩呈紧密状态的细胞外壁膨胀变软，水分进入细胞后，原来以结晶或其他形态固定于细胞内的化合物溶解并在药材内部形成较高的渗透压，压差使高浓度的内容物渗出并溶于水中，加热提取时，随着温度的升高，内容物向水中扩散的速度加快，药材内部细胞不断破裂，水溶液浓度也越来越高，直至药材与水之间的物质交换达到相对平衡状态。李维德[18]在对中药材加水浸泡提取工艺的研究中发现浸泡比不浸泡直接加热提取所得提取物平均得率高出6.89%，经充分浸泡后再加热煎煮提取有效成分效果明显可提高提取得率，减少煎煮时间，节省能源消耗，提高经济效益，但中药材加水浸泡时间并非越长越好。本研究中新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B 等多种成分均在提取105 min后出现含量下降的趋势，具体机理有待进一步研究。

浸泡过程中观察到金银花表面在入水片刻后开始出现褐色斑点，且靠近水面的金银花褐变更为严重，推测该现象源自酶促褐变。绿原酸（3-咖啡酰奎宁酸）、隐绿原酸（4-咖啡酰奎宁酸）、新绿原酸（5-咖啡酰奎宁酸）、异绿原酸 A（3，5-二咖啡酰奎宁酸）、异绿原酸 B（3，4-二咖啡酰奎宁酸）、异绿原酸 C（4，5-二咖啡酰奎宁酸）均为单咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸所组成的绿原酸异构体。绿原酸类物质其分子结构中有多元酚、不饱和双键及酯键3 个不稳定部分，前两者易被氧化，后者易发生水解[19]。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是主要参与金银花酶促褐变的酶类，通过催化酚类物质发生酶促氧化，导致褐变[20]，绿原酸类物质其分子结构中有多元酚，可作为PPO 底物，金银花中PPO 主要存在叶绿体内囊体的基质上[21]，当浸泡过程中药材内部细胞不断破裂，酶和底物之间的屏障被打破，发生氧化反应以及一系列的连锁反应[22]。有研究证明采后鲜金银花的酶促褐变会引起绿原酸和木犀草苷的降解，因此推测干燥金银花在浸提过程中复水后酶被激活发生褐变。

综上，推测在内容物溶出和酶促褐变的双重作用下，产生了浸泡 0、30、60、90 min 不同条件下各化合物的变化规律。绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸C 在95 ℃提取效果比80 ℃时好；獐牙菜苷在两种温度下提取效果相仿；异绿原酸A 在80 ℃下提取效果比95 ℃时好。水提液中各成分含量从多到少依次为绿原酸＞异绿原酸A＞异绿原酸C＞隐绿原酸＞新绿原酸＞獐牙菜苷＞异绿原酸B，绿原酸在7 种化合物总量中占比最高达58%。除异绿原酸A 外，各化合物在90 min～120 min 均可得到较为理想的提取效果。由于绿原酸在水提液中含量最高，同时也是金银花及其产品评价的主要指标成分，以绿原酸为主其他化合物为辅综合结合实际生产效率考量水提液的提取效果。绿原酸的最佳提取条件为浸泡30 min 95 ℃提取，结合7 种化合物总提取量的变化，提取90 min 时含量较高，因而选择提取方式为浸泡30 min 95 ℃提取90 min时，绿原酸的提取量和7 种化合物总量均能得到良好的保证。

3 结论

浸泡对金银花的提取产生一定的影响，但不是时间越久效果越好，绿原酸在浸泡30 min 后提取效果最好，獐牙菜苷在浸泡90 min 后提取效果最好，隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C 均为：直接提取＞浸泡30 min＞浸泡90 min 和浸泡60 min，适当的浸泡能够加快提取进程，提高得率，降低耗能，综合考虑7 种有机酸类成分，浸泡30 min 后95 ℃提取90 min 的提取条件，既能保证较高的活性成分提取量又能保证生产效率。