高效液相色谱法测定汉源金丝皇菊中3个活性成分的含量

2020-01-03李含春全维明

中国医药指南 2019年32期

李含春祁娟全维明

（雅安市食品药品检验所，四川雅安 625000）

菊花为菊科，植物菊的干燥头状花序[1]，是我国传统的常用中药材之一。根据中医药理论，结合现代科学研究，其中绿原酸、木犀草苷和3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸为主要活性成分，具有散风清热，平肝明目，清热解毒的功效，常用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒等。皇菊中的金丝皇菊因其富含绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和其他人体有益物质，具有香、甜、润三大特点，受到广泛关注。金丝皇菊以江西、安徽、青海等为主要产地，其中安徽金丝皇菊尤为出名，以口感好、花片厚为特色，为此，雅安市汉源县从安微歙县引种金丝皇菊。目前，菊花中亳菊、滁菊、贡菊、杭菊、怀菊都有规范的检验标准，而金丝皇菊无正式的产品标准及检验标准，为考察金丝皇菊的药用价值，对金丝皇菊进行了研究，建立了同时测定金丝皇菊中3个活性成分的高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定方法，作为质量控制方法之一。

1 仪器与试药

1.1 仪器：1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪（Agilent公司）；XS205 DualRange电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；SCQ-双频普通超声波清洗机（上海声彦超声波仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂：金丝皇菊（水分含量为10.2%）产地为汉源；绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110753-201817 含量：96.8%）；木犀草苷对照品（Stanford Chemicals-Stanford Analytical Chemicals Inc，批号：CRS-742884，含量：98.85%）；3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸对照品（Stanford Chemicals-Stanford Analytical Chemicals Inc，批号：DFA-222038，含量：98.78%）；甲醇（成都市科隆化学品有限公司，色谱纯）、乙腈（成都市科隆化学品有限公司，色谱纯），磷酸（成都市科龙化工试剂厂，优级纯），水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件。色谱柱：采用Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），（梯度洗脱0～11 min，10%～18% A；11～30 min，18%～20% A；30～40 min，20% A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：348 nm；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液。精密称取绿原酸对照品15.12 mg、木犀草苷对照品9.64 mg、3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸对照品32.45 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液Ⅰ（含绿原酸、木犀草苷、3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸的质量浓度分别为146.36 μg/mL、95.29 μg/mL、320.54 μg/mL），置10 ℃以下保存备用。精密量取混合对照品溶液Ⅰ25 mL于100 mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶液至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液Ⅱ（含绿原酸、木犀草苷、3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸的质量浓度分别为36.59 μg/mL、23.82 μg/mL、80.14 μg/mL），置10 ℃以下保存备用。

2.2.2 供试品溶液。称取金丝皇菊粉末（过一号筛）约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率45 kHz）40 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，置10 ℃以下保存备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性。精密量取“2.2.1”项配制的混合对照品溶液Ⅱ和供试品溶液各5 μL，按照“2.1”项下条件进样，结果见图1。3个化合物均能完全分离，供试品溶液的杂质对绿原酸、木犀草苷、3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸的色谱峰不构成干扰，该方法专属性良好。

图1 混合对照品（A）和供试品（B）的HPLC图

2.3.2 线性关系考察。精密量取“2.2.1”项配制的混合对照品溶液Ⅰ1、2、5、10、20 mL，分别置于20 mL棕色量瓶中，用70%甲醇溶液稀释至刻度，组成5个不同浓度梯度系列。按照“2.1”项下条件进样5 μL，以对照品质量浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程（表1）。结果在规定的进样浓度范围内，各化合物均呈良好的线性关系。分别以信噪比（S/N）为10∶1和3∶1时，确定其定量下限和检测下限，结果见表1。

表1 3个活性成分的回归方程、相关系数和线性范围、定量下限和检测下限

2.3.3 精密度试验。精密量取“2.2.1”项配制的混合对照品溶液Ⅱ5 μL，按“2.1”项下条件连续进样6次，记录各成分的峰面积，结果绿原酸、木犀草苷、3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸峰面积的RSD分别为0.2%、0.4%、0.2%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验。取金丝皇菊粉末（过一号筛）约0.25 g，精密称定，按照“2.2.2”项下条件处理后，按“2.1”项下条件分别于0、2、4、6、8、12、16、24 h时间点进样测定，记录各成分的峰面积。结果绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的平均峰面积分别为321.31、311.92、658.79，RSD分别为0.13%、0.15%、0.09%。结果表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

2.3.5 重复性试验。按“2.2.2”项下方法，制备供试品溶液4份，按“2.1”项下条件进样测定，计算各组分的含量。结果测定得四份供试品中绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量百分比平均值（n=4）分别为0.4213%、0.2643%、0.7600%，RSD均为0.4%。表明该方法的重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验。称取3份金丝皇菊粉末（过一号筛）约0.1 g，精密称定，分别精密加入“2.2.1”项配制的混合对照品溶液Ⅰ2.5 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，并记录峰面积，计算回收率，结果见表2。

表2 金丝皇菊中3个活性成分的加样回收率

2.4 样品测定。取金丝皇菊粉末（过一号筛）约0.25 g，精密称定4份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密量取“2.2.1”中配制的混合对照品溶液Ⅱ和供试品溶液各5 μL，按“2.1”项下条件进样测定，计算得金丝皇菊中绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量，结果见表3。

表3 金丝皇菊样品测定结果

3 讨论

3.1 系统适应性试验中，3，5-O-双咖啡酰基奎宁酸对照品的理论塔板数在50000以上；绿原酸色谱峰与木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸色谱峰的分离度分别为49.05、14.68，＞1.5，表明三个待测物质色谱峰完全分离；各峰的拖尾因子分别为1.021、1.034、1.041，且供试品溶液的杂质对所测成分的色谱峰不构成干扰，本方法能同时测定金丝皇菊中绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量。

3.2 样品测定得汉源金丝皇菊的平均含量分别为0.4213%、0.2643%、0.7600%，含量均高于药典规定，而据吕紫璇等文献测定得昆仑雪菊、白菊花、野菊花等10种菊花中绿原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量分别在0.131～0.805%、0.092～3.753%、0.284～1.594%[2]，比较这几种菊花中三种有效物质的含量，汉源金丝皇菊中绿原酸的含量高于雪菊，木犀草苷的含量高于白菊花和野菊花，3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸的含量高于雪菊和野菊花，表明汉源金丝皇菊中含有丰富的有效物质，有益于人体健康。