制备色谱分离纯化桑叶提取物的研究

2020-01-01王露唐付杰徐笑非詹力王星敏

应用化工 2019年12期

王露，唐付杰，徐笑非，詹力，王星敏，2

(1.重庆工商大学环境与资源学院，重庆 400067；2.重庆市特色农产品加工储运工程技术研究中心，重庆 400067)

桑叶含有多种生理活性物质，具有降血糖[1]、降血脂[2]、抗炎[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤、抗菌抗病毒[5]等多种药理作用，常作为天然着色剂、抗氧化剂和功能性食品原料[6]，国家卫生部将桑叶列为药食同源的中药[7]，卫计委批准桑叶提取物作为新食品原料[8]。制备型高效液相色谱法(P-HPLC)是目前最成熟、应用最为广泛的分离纯化技术，具有纯度高、产率高、分离速度快等优点。目前我国对桑叶开发利用仅为初加工，多为复方制剂，而天然活性成分单体的应用不多，影响桑叶高附加值的提取物经济推广。故开展桑叶高活性成分筛选及开发有助于提高桑叶综合利用，满足广大人民群众医疗健康的需求。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

桑叶，重庆市农科院；无水乙醇、磷酸均为分析纯；乙腈、甲醇均为色谱纯；异槲皮苷标准品(≥98%)。

1260高效液相色谱仪；CJF-0.05小型高压反应釜；DHG-9070A台式电热恒温鼓风干燥箱；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵；KC-100高速粉碎机；IR Prestige-21傅里叶变换红外光谱仪；KQ-250V超声波清洗机；Gelailnest半制备色谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 桑叶粗提液的制备分别称取过筛的干燥桑叶5 g于水热反应釜内胆中，按乙醇体积与桑叶质量比为7∶1 mL/g加入体积分数为57%的乙醇，于154 ℃的烘箱中水热反应80 min后，过滤，分别收集滤渣和滤液，滤液即含有异槲皮苷醇提液；滤渣集中收集后以待二次利用。

1.2.2 活性成分检测及分析用分析型高效液相色谱分析。色谱柱为Hypersil ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相是体积比20∶80的乙腈和0.5%磷酸水溶液，流速为1 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为10 μL；通过对样品进行分析型液相色谱全扫描，确定异槲皮苷的最大吸收波长为350 nm。

1.2.3 活性成分分离纯化半制备型液相色谱条件为色谱柱(C18-8)，流动相为乙腈-水(20∶80)；进样量10 mL，流速20 mL/min；检测波长350 nm。按照上述方法进Gelailnest制备色谱仪，根据样品的保留时间进行分段收集，得到4种馏分A、B、C、D。并按照式(1)计算分离度。

(1)

其中，tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1、W2为此相邻两峰的峰宽。《中国药典》规定：R≥1.5，视为完全分离；R<1，部分重叠。通常R=1.5可作为已完全分离的标志。

1.2.4 单体制备采用冷冻干燥法将收集的 4种馏分和桑叶粗提液分别进行干燥，得到A、B、C、D和提取复合物的粉末状固体物，称其质量记为WA、WB、WC、WD和W1。分别准确称取2 mg，用57%的乙醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，采用高效液相色谱分析方法进行纯度测定，代入标准曲线计算出浓度C，则制备率的计算公式如下：

(2)

式中C——粗提液中各成分的浓度，mg/mL；

V——粗提液的体积，mL；

W——制备得到的各单体的量，mg。

1.2.5 产品红外分析采用衰减全反射模式测定制备得到的4种成分的傅里叶变换红外光谱，分析制备得到的粉末的表面官能团，测定波数为4 000～500 cm-1。

2 结果与讨论

2.1 分离纯化适宜条件筛选

2.1.1 流动相体系及配比的选择当流速为20 mL/min，进样量为10 mL，分别考察了不同比例的甲醇-水和乙腈-水为流动相对异槲皮苷分离效果的影响，结果见表1。

表1 不同流动相体系及配比对异槲皮苷分离效果的影响

由表1可知，随着溶剂极性的减小，异槲皮苷的保留时间、分离度及异槲皮苷质量分数逐渐减小。当甲醇的比例低于30%时，流动相洗脱能力不强，异槲皮苷不能和其它活性成分很好的分离，并且拖尾严重，导致异槲皮苷收集不完全，从而使得产品的纯度较低；当甲醇比例大于50%时，虽能在较短时间得到组分，但由于洗脱能力过强，使得异槲皮苷与其他成分无法分离[9]，纯度低。而当流动相为V乙腈∶V水=20∶80时，分离度为1.74，分离效果好，其纯度为98.13%。与甲醇体系洗脱比较，异槲皮苷在甲醇体系中靠近异槲皮苷的其它活性成分为黄酮类物质，故比较难分开，而乙腈则有一定的手性拆分能力[10]，所以乙腈体系可以得到较高质量分数的异槲皮苷及其它成分。

2.1.2 流速对异槲皮苷分离效果的影响当V乙腈∶V水=20∶80，进样量为10 mL时，分别考察了流速为15，20，25 mL/min异槲皮苷分离效果的影响，结果见图1。

图1 流速对异槲皮苷分离效果的影响

由图1可知，随着流速的增大，异槲皮苷的保留时间减少，分离度降低，样品质量分数减小。较低的流速一般峰高较高，分离度也较大，但流速低，洗脱时间延长[11]。若以15 mL/min洗脱时，样品的保留时间较长，流动相用量多，蒸馏费时。而以25 mL/min洗脱时，流速增加，因固定相内扩散阻力起控制作用，溶质组分在固定相和流动相两相之间的分配偏离分配平衡的幅度增加，分离度降低，色谱峰扩展加剧，因而溶质稀释程度增加，流动相消耗增大，同时也增加了经济负担[12]。综合各种因素，实验选择20 mL/min的流速进行考察。

2.1.3 粗提液不同进样量对异槲皮苷分离效果的影响当V乙腈∶V水=20∶80，流速为20 mL/min时，考察了进样量分别为5，8，10 mL对异槲皮苷分离效果的影响，结果见图2。通过增加进样量可以提高制备率[13]，但分离度却随着进样量的增加呈现下降趋势。

图2 进样量对异槲皮苷分离效果的影响

由图2可知，异槲皮苷的分离度随着进样量增大而降低，但是仍然大于1.5，可视为完全分离，异槲皮苷质量分数98.78%，在保证纯度的情况下，尽量增加样品处理量，提高制备率，因此，进样量为10 mL 最为合适。

2.2 产品检测与分析

2.2.1 制备单体的HPLC定性分析将1.2.4节配制好的制备单体溶液按HPLC分析条件进样分析，与标品溶液出峰时间进行对照，具体情况见表2，可以确定A、B、C、D 分别是绿原酸、芦丁、异槲皮苷和紫云英苷。因此，通过单次PHPLC分离除了可以得到异槲皮苷，还可得到绿原酸、芦丁和紫云英苷3种活性物质，整个过程用时较短、毒性低、分离效果较好，可连续进样制备，桑叶提取液的半制备液相色谱图出峰情况见图3。

表2 制备单体溶液与标品溶液高效液相出峰时间对照表

图3 粗提物溶液的半制备液相色谱图

2.2.2 制备单体的红外分析通过测定制备单体的红外光谱，结果见图4。

图4 红外光谱图Fig.4 The infrared spectrogram

2.3 制备率计算及效益分析

2.3.1 制备单体的制备率计算合并多次粗提液共500 mL，其中绿原酸、芦丁、异槲皮苷和紫云英苷的浓度分别为0.501 8，0.157 8，0.369 4，0.068 mg/mL，可得出500 mL溶液中含有的绿原酸、芦丁、异槲皮苷和紫云英苷的量分别是250.9，78.9，182.45，34 mg。将500 mL粗体液浓缩至20 mL后，半制备色谱连续进样2次，收集合并相应馏分，经冷冻干燥后称其质量W，按照式(2)计算各组分的得率，结果见表3。

表3 制备单体的制备率

2.3.2 效益分析除了目标产物的质量分数、产量、消耗时间，成本也是PHPLC的主要考虑因素。市面上，乙腈(色谱纯)售价360元/4 L，即乙腈为0.09元/mL，按照V乙腈∶V水=20∶80为流动相20 mL/min为流速时，单次制备需要耗时40 min，乙腈的用量是160 mL，即消耗的流动相的成本为14.4元/次。国内市场上含量≥98%的异槲皮苷售价为1 000元/20 mg，含量≥98%的绿原酸售价为139元/20 mg，含量≥98%的芦丁售价为140元/20 mg，含量≥98%的紫云英苷售价为500元/20 mg。本次实验所得到的4种产品的质量根据市面价格折算，预计收益约3 091元。