升降丸质量标准研究

2020-01-01奚肇庆田立元

中国医药导报 2020年31期

陆超奚肇庆吴磊田立元▲

1.南京中医药大学附属医院药学部，江苏南京 210029；2.南京中医药大学附属医院急诊科，江苏南京 210029

升降丸由生大黄、姜黄、炒僵蚕、蝉蜕组成，其方源于清代杨粟山所著《伤寒温疫条辨》一书，具有宣泄三焦，行气解散，调和气血，升清降浊之功效[1-4]。用于恶寒发热，寒战高热，烦躁不宁等症状。大量临床研究显示[5-10]，升降方可有效降低患者体温，缩短发热持续时间并有效防止体温复升，有利于减少高热并发症的发生。方中炒僵蚕能胜风除湿、清热解郁[11]；姜黄具有行气散郁、辟疫除烦之功效[12-13]；大黄上下通行，清热泻火。大黄是方中一味主药，其主要活性成分为蒽醌类化合物，包括结合型蒽醌和游离型蒽醌两类，具有止血、抗菌、排毒等药理作用[14-15]，与本方的功效相一致，本研究将蒽醌类成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚作为指标，以控制升降丸的质量。

1 仪器与试药

1.1 实验仪器

Waters-2695 高效液相色谱仪、Waters-2998 二极管阵列检测器（美国，Waters 公司）；万分之一天平（BP-211D 型，德国赛多利斯公司）；医用超声波清洗仪（KQ-1000E 型，昆山市超声仪器有限公司）；HH-4 数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）。

1.2 试剂与试药

升降丸（江苏省中医院制剂部自制，批号：201708 001、201708002、201708003）；大黄对照药材（鉴别用，批号：121249-201304）、姜黄对照药材（鉴别用，批号：121188-201304）、大黄素对照品（含量测定用，批号：110756-201512）、大黄酸对照品（含量测定用，批号：110757-200106）、芦荟大黄素对照品（含量测定用，批号：110795-201308）、大黄酚对照品（含量测定用，批号：110796-201319）、大黄素甲醚对照品（含量测定用，批号：110758-201405），以上均购自中国食品药品检定研究院；水为超纯水，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 姜黄取升降丸2 g，研细，加无水乙醇50 mL，摇匀，放置30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇2 mL 使之溶解，作为供试品溶液；取不含姜黄的阴性粉末，同法制备阴性对照品溶液；另取姜黄对照药材0.2 g，同法制成姜黄对照药材溶液。吸取上述3 种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）为展开剂，展开，取出，晾干，置日光下检视。在供试品溶液色谱中，与对照药材溶液色谱相应位置上显示相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。见图1。

图1 姜黄薄层色谱鉴别图

2.1.2 大黄取升降丸5 g，研细，加入甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水100 mL 使之溶解，加入盐酸7 mL，加热回流30 min，取出，放冷，滤液用乙醚振摇提取2 次，每次50 mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇1 mL 溶解，作为供试品溶液。另取不含大黄的阴性溶液，同法制备阴性对照品溶液；取大黄对照药材粉末0.2 g，加甲醇20 mL，同法制成对照药材溶液。吸取上述3 种溶液各5 μL，分别点于相同的以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H 薄层板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂展开，取出，晾干，置于氨蒸气中熏后斑点变为红色。在供试品溶液色谱中，与对照药材溶液色谱相应位置上显示相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。见图2。

图2 大黄薄层色谱鉴别图

2.2 含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，置于量瓶中，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含芦荟大黄素108.9 μg、大黄酸115.0 μg、大黄素119.0 μg、大黄酚119.0 μg、大黄素甲醚56.8 μg 的混合标准品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备将升降丸研细，取2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL 和盐酸3 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，精密称定，加甲醇补足减失的重量，滤过，精密量取滤液5 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL 量瓶中，超声处理20 min，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得[16]。

2.2.3 色谱条件与系统适应性试验色谱条件Hedera C18ODS-2 色谱柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；以甲醇-0.1%磷酸水（80∶20）为流动相，检测波长为254 nm，柱温：25℃；流速：1.0 mL/min。

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪测定。供试品色谱与对照品色谱在相同的位置有较大吸收，阴性对照无干扰。理论板数按大黄素峰计算不低于3000。见图3。

图3 升降丸液相色谱图

2.2.4 线性关系考察取上述对照品溶液，用甲醇稀释至含芦荟大黄素108.90、72.60、48.40、32.27、21.51、14.34、9.56、6.37 μg/mL，含大黄酸115.00、76.67、51.11、34.07、22.72、15.14、10.10、6.73 μg/mL，含大黄素119.00、79.33、52.89、35.26、23.51、15.67、10.45、6.96 μg/mL，含大黄酚119.00、79.33、52.89、35.26、23.51、15.67、10.45、6.96 μg/mL，含大黄素甲醚56.80、37.87、25.24、16.83、11.22、7.48、4.99、3.32 μg/mL 的对照品溶液。精密吸取各不同浓度的对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪中测定。经线性回归分析显示，芦荟大黄素在6.37～108.90 μg/mL范围内，大黄酸在6.73～115.00 μg/mL 范围内，大黄素在6.96～119.00 μg/mL 范围内，大黄酚在6.96～119.00 μg/mL范围内，大黄素甲醚在3.32～56.80 μg/mL 范围内，分别与峰面积的积分值呈良好的线性关系。见表1。

表1 线性关系考察结果

2.2.5 精密度试验取同一个对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪中，重复测定6 次，以峰面积积分值计算，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚相对标准偏差（RSD）值分别为0.49%、0.36%、0.22%、0.46%、1.64%。结果显示，仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验取同一个批次（201708001）的升降丸2 g，研细，共6 份，精密称定，按“2.2.2”项下处理方法制备供试品溶液。分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪中，测定，以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量计算，RSD 值分别为0.87%、0.76%、1.02%、1.21%、1.37%。结果显示，该方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验取同一个供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件，于0、2、4、6、8、12 h 分别进样，测定色谱峰面积，分别以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量计算，RSD 值分别为0.67%、0.94%、0.88%、1.43%、1.13%。结果显示，样品在12 h 内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验精密吸取已知含量的升降丸（201708001）1 g，共6 份，分别加入芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量。按“2.2.2”项下处理方法制备供试品溶液，进样，测定，计算。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚回收率分别为89.91%、92.87%、91.24%、93.50%、88.64%，RSD 值分别为2.12%、1.06%、1.67%、2.31%、2.46%。结果显示，该方法的准确性良好，符合含量测定的要求。见表2。