天麻芎苓止眩片对自发性与肾性高血压模型大鼠影响的比较研究

刘林，李弘，王宇红，任卫琼，蔺晓源，李苏，柏正平1,*

(1. 湖南省中医药研究院， 长沙 410013； 2. 湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007； 3. 湖南中医药大学， 长沙 410208；4.湖南中医药大学科学创新中心，长沙，410007)

高血压是我国常见的心血管疾病之一，长期处于高血压状态容易引发心、脑、肾和血管等靶器官不同程度的损害，严重危害人类的健康[1-2]。本课题组以与人类原发性高血压相似的动物—自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)和继发性高血压动物—两肾一夹(2K1C)高血压大鼠(renal hypertensive rats，RHR)为研究对象。采用具有平肝熄风、清热活血、利湿化痰之功效天麻芎苓止眩片(Tianma Xiongling Zhixuan Tablet，TXZT)进行干预，比较药物对两种高血压模型大鼠的血压、生化功能等指标的影响。比较探讨TXZT对SHR大鼠和RHR大鼠的降压效应和改善高血压病理进展的特点，阐明其内在防治规律，为抗高血压中药新药开发研究动物模型选择和临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，雄性，8～10周龄，体重180～220 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司实验动物中心【SCXK(湘)2016-0002】。SPF级SHR大鼠，雄性，8～10周龄，体重180～200 g，购于北京维通利华实验动物中心【SCXK(京)2016-0006】。SPF级WKY大鼠，雄性，8～10周龄，体重180～200 g，购于北京维通利华实验动物中心【SCXK(京)2016-0006】。饲养于湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心【SYXK(湘)2015-0003】，实验操作过程中符合实验动物伦理学要求(伦理审批号：ZYFY20161012)。

1.1.2 试剂与仪器

TXZT(每片0.46 g)，湖南中医药大学第一附属医院药剂科制备，批号20170315，TXZT成人临床日用量为每日5.52 g。厄贝沙坦片(每片75 mg)，扬子江药业集团北京海燕药业有限公司生产，批号16112152，厄贝沙坦片成人临床日用量为每日300 mg。

尿素氮(BUN)，批号171024；肌酐(Crea)，批号170952；肌酸激酶(CK)，批号170952，乳酸脱氢酶(LDH)，批号170952；以上试剂为北京中生北控工程公司产品。

BP2010无创血压检测仪，北京软隆科技有限责任公司；CA-500血液分析仪，山东兰桥医学科技有限公司产品；RT-1904C型半自动生化分析仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司产品；显微镜摄影系统为Olympus产品。

1.2 方法

1.2.1 对RHR模型大鼠作用的研究

(1) 2K1C法造模

动物适应性饲养3 d后，以无创血压检测仪检测大鼠血压，剔除血压异常者，按照血压随机分组，随机抽取10只大鼠为为假手术组，其余大鼠均按照2K1C造模方法进行如下手术造模，造模后连续4周测定血压，以收缩压≥140 mmHg，且较术前血压超出20 mmHg者为造模成功。假手术组大鼠除不结扎肾动脉外，其余手术操作均同上。

(2)分组及给药

将成模大鼠按照收缩压随机分为5组，每组10只。分别为：模型对照组、厄贝沙坦对照组、天麻芎苓止眩片组高、中、低剂量组。模型组灌胃蒸馏水，阳性药组给予厄贝沙坦27 mg/kg；TXZT高、中、低剂量组分别按2.0 g/kg、1.0 g/kg、0.5 g/kg大鼠灌胃给药；每天给药1次，10 mL/kg，连续给药4周。

(3)指标检测

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞转染48 h后，收集各组细胞，PBS清洗2次，每管细胞样品中加入 Binding Buffer 500 μL轻轻重悬细胞，加入AnnexinV-FITC 5 μL 混匀，加入 PropidiumIodide 5 μL，混匀，室温避光温育15 min，流式细胞术检测细胞凋亡。数据结果中包含4个象限，其中上左象限(UL)表示碎片或损伤细胞，上右象限(UR)表示晚期凋亡细胞，下左象限(LL)表示正常细胞，下右象限(LR)表示早期凋亡细胞。

①血压的测定：分别在给药前及药后各周，采用尾动脉测压法测量大鼠收缩压(SBP)和舒张压(DBP)。②LVMI的测定：给药4周后，大鼠处死后迅速取出心脏，沿房室环剪去心房，沿室间隔剪去右心室，保留室间隔、左心室肌，以滤纸吸干后称重，计算左室质量与体重之比，以左室质量(LVM) 与体重之比作为左心室指数(LVMI)，计算公式：LVMI=LVM/BW。③生化指标检测：末次给药后，实验动物禁食12 h，麻醉后腹主动脉采血，不抗凝，离心(4500 r/min，10 min)分离血清，-80℃保存备用。严格按照试剂盒说明书的步骤操作检测生化指标。④病理检查大鼠取血后，迅速取左心室、肾、脑及主动脉，清洗干净，置于4%多聚甲醛中固定，浸蜡包埋，常规切片，HE染色，观察组织形态学变化。

1.2.2 对SHR模型大鼠作用的研究

(1)分组及给药

将50只SHR大鼠按照收缩压值随机分为：模型组、厄贝沙坦片组、天麻芎苓止眩片组高、中、低剂量组，每组10只，另设10只WKY大鼠为正常组。厄贝沙坦片组大鼠给予厄贝沙坦片27 mg/kg；TXZT高、中、低剂量组大鼠分别按2.0 g/kg、1.0 g/kg、0.5 g/kg大鼠给予药物；模型组和正常组分别给予等量蒸馏水；每天给药1次，10 mL/kg，灌胃给药，连续给药4周。

(2)指标检测 SHR大鼠收缩压(systolic blood pressure，SBP)和舒张压(diastolic blood pressure，DBP)，LVMI指数，生化及病理指标检测及方法同RHR大鼠实验。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 对不同高血压模型大鼠SBP和DBP的影响

2.1.1 对RHR大鼠的影响

2.1.2 对SHR大鼠的影响

与SHR模型组比较，天麻芎苓止眩片高、中、低剂量组大鼠给药后各周的收缩压明显降低，第2、3、4周的舒张压明显降低，差异均有统计学意义(P< 0.01 或 0.05)；天麻芎苓止眩片中、低剂量组第3、4周的舒张压明显降低，差异均有统计学意义(P< 0.01 或 0.05)。(见图3，图4)

2.2 对两种不同高血压模型大鼠LVMI的影响

2.2.1 对RHR大鼠LVMI的影响

与假手术组比较，模型组大鼠LVM明显增大，差异具有统计学意义(P< 0.05)。其他各组LVM和LVMI差异无统计学意义(P> 0.05)。与模型组比较，其他各给药组RHR大鼠LVM减轻，LVMI减小，但差异无统计学意义(P> 0.05)。(见图5)

2.2.2 对SHR大鼠LVMI的影响

与WKY组比较，模型组及其他各组大鼠LVMI明显增加，差异具有统计学意义(P< 0.05)。其他各组LVM差异无统计学意义(P> 0.05)。与模型组比较，高剂量组LVM明显减小，差异具有统计学意义(P< 0.05)，其他各给药组SHR大鼠左心室LVM减轻，LVMI减小，但差异不具有统计学意义(P> 0.05)。(见图6)

注：自身前后比较， *P< 0.05, **P< 0.01;与假手术组比较, ●P< 0.05, ●●P<0.01;与模型组比较，▲P< 0.05, ▲▲P< 0.01。下图同。图1 天麻芎苓止眩片对RHR大鼠SBP的影响Note. Self comparison, before and after drug administration， *P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the sham operation group, ●P< 0.05, ●●P< 0.01. Compared with the model group, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01. The same in the following figure.Figure 1 Effect of TXZT on the systolic blood pressure in the RHR rats ± s, n=10)

图2 天麻芎苓止眩片对RHR大鼠DBP的影响Figure 2 Effect of TXZT on the diastolic blood pressure in the RHR rats ± s, n=10)

2.3 对两种不同高血压模型大鼠心、肾功能生化指标的影响

2.3.1 对RHR大鼠心、肾功能生化指标的影响

如表1所示，与假手术组比较，模型组大鼠LDH、CK、CREA、BUN值显著升高，差异具有统计学意义(P< 0.01 或 0.05)。高、中、低剂量组大鼠CREA、BUN值显著升高，差异具有统计学意义(P< 0.05)，其他大鼠血常规指标差异无统计学意义(P> 0.05)。与模型组比较，高剂量组大鼠CK、CREA、BUN值显著降低，差异具有统计学意义P< 0.01 或 0.05)。中剂量组大鼠LDH、CK、CREA、BUN值显著降低，差异具有统计学意义(P< 0.01 或 0.05)。低剂量组大鼠BUN值显著降低，差异具有统计学意义(P< 0.05)。其他给药组生化指标值差异不具有统计学意义(P> 0.05)。提示，天麻芎苓止眩片有一定的改善RHR大鼠心、肾功能药理作用。

注：自身前后比较，*P< 0.05,**P < 0.01;与WKY组比较,●P< 0.05,●●P< 0.01;与模型组比较,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01。下图同。图3 天麻芎苓止眩片对SHR大鼠SBP的影响Note. Self comparison, before and after drug administration, *P < 0.05, **P< 0.01. Compared with the WKY group,●P< 0.05, ●●P< 0.01. Compared with the model group, ▲P< 0.05, ▲▲P< 0.01. The same in the following figure.Figure 3 Effect of TXZT on the systolic blood pressure in the SHR rats ± s，n=10)

图4 天麻芎苓止眩片对SHR大鼠DBP的影响Figure 4 Effect of TXZT on the diastolic blood pressure in the SHR rats ± s，n=10)

2.3.2 对SHR模型大鼠心、肾生化指标的影响

如表2所示，与WKY组比较，模型组大鼠LDH、CK值显著升高，差异具有统计学意义(P< 0.05)。其他各给药组大鼠血常规指标差异无统计学意义(P> 0.05)。

与模型组比较，高、中、低剂量组大鼠CK、CREA、CREA、BUN值有一定降低，但差异不具有统计学意义(P> 0.05)。提示，与WKY组比较，SHR大鼠心功能生化指标存在明显异常。天麻芎苓止眩片有一定的改善SHR大鼠心功能药理作用趋势。

2.4 对两种不同高血压模型大鼠靶器官的影响

2.4.1 对RHR大鼠心、肾、脑、主动脉病理形态的影响

HE染色病理学观察，模型大鼠组与假手术组大鼠心、肾及主动脉存在一定的病理变化，主要表现左室心肌细胞肥大或部分消失,细胞横径增大，被纤维组织替代，并伴有炎性细胞浸润。肾小动脉管壁增厚，管腔狭窄，肾小管及肾小球均出现不同程度的萎缩，同时伴有肾间质纤维化。主动脉内膜明显增厚，肌纤维排列不整齐，粗细不一。脑组织未见明显变化。经过天麻芎苓止眩片治疗4周后，心肌纤维排列较整齐，细胞横径大小差异不大，肾小管及肾小球萎缩程度减轻，主动脉内膜完整、排列整齐。天麻芎苓止眩片能较好的改善RHR大鼠左心室、肾脏、血管病理结构，对高血压靶器官具有一定的保护作用。(见图7)

2.4.2 对SHR大鼠心脏、肾、脑、主动脉病理形态的影响

给药治疗4周，病理检查提示，WKY组大鼠血管内膜完整，细胞排列整齐清晰、无明显增生；模型组大鼠血管内膜明显损伤，不完整，明显增厚；止眩片高剂量组大鼠血管病理改善，内膜较光滑，排列较整齐复方，中剂量组大鼠血管内膜轻损伤，平滑肌细胞增殖，低剂量组大鼠血管内膜轻损伤，中膜增厚，平滑肌细胞增殖。(见图8)

注：与假手术组比较,●P<0.05,●●P<0.01；与模型组比较，▲P< 0.05, ▲▲P< 0.01。图5 天麻芎苓止眩片对RHR模型大鼠LVM及LVMI的影响Note. Compared with the sham operation group, ●P< 0.05, ●●P< 0.01. Compared with the model group, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01.Figure 5 Effects of TXZT on the left ventricular mass and left ventricular mass index of the RHR rat models

注：与WKY组比较，●P<0.05, ●●P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05,▲▲P<0.01。图6 天麻芎苓止眩片对SHR模型大鼠LVM及LVMI的影响Note. Compared with the WKY group, ●P<0.05,●●P<0.01. Compared with the model group, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01.Figure 6 Effects of TXZT on the left ventricular mass and left ventricular mass index of SHR rat ± s，n=10)

表1 天麻芎苓止眩片对RHR大鼠心、肾功能生化指标的影响Table 1 Effects of TXZT on biochemical indexes of heart and kidney function in the RHR ± s，n=10)

注：与假手术组比较,●P< 0.05,●●P< 0.01;与模型组比较，▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

Note. Compared with the sham operation group,●P<0.05,●●P<0.01. Compared with the model group,▲P<0.05,▲▲P<0.01.

表2 对SHR模型大鼠心、肾功能生化指标的影响

注：与WKY组比较,●P< 0.05,●●P< 0.01; 与模型组比较，▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

Note. Compared with the WKY group,●P< 0.05,●●P< 0.01. Compared with the model group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

注：a，假手术组；b，模型组；c，厄贝沙坦组；d，止眩片高剂量组；e，止眩片中剂量组；f，止眩片低剂量组。图7 RHR大鼠左心室(A)、肾(B)、脑(C)、主动脉(D)病理形态检测(HE染色)Note. a, Sham operation group. b，Model group. c, Irbesartan group. d, High dose group. e，Medium dose group. f, Low dose group.Figure 7 Pathological changes of the left ventricle (A), kidney (B), brain (C) and aorta (D) in the RHR rats (HE staining)

注：a，WKY组；b，模型组；c，厄贝沙坦组；d，止眩片高剂量组；e，止眩片中剂量组；f，止眩片低剂量组。图8 SHR大鼠左心室(A)、肾(B)、脑(C)、主动脉(D)病理形态检测(HE染色)Note. a, WKY group. b，Model group. c, Irbesartan group. d, TXZT high dose group. e， TXZT medium dose group. f, Low Dose Group.Figure 8 Pathological changes of the left vntricle(A), kidney (B), brain (C) and aorta (D) in the SHR rats(HE staining)

3 讨论

高血压严重危害人类健康，长期处于高血压状态可造成心、脑、肾和血管等靶器官不同程度的损害。对应于人类高血压病理机制，高血压大鼠模型也可分为两大类：自发性高血压大鼠(SHR)和继发性高血压大鼠模型(如：两肾一夹型肾性高血压大鼠(RHR)等)[3]。大鼠SHR从发病机制、并发症、外周血管阻力变化、对盐的敏感性等多方面来讲，都与人类高血压相似，是目前国际上公认的最接近人类原发性高血压的动物模型，已广泛应用于原发性高血压及抗高血压药物筛选[4-5]。两肾一夹法高血压大鼠是研究肾血管性高血压最常用的模型，以肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)激活为主，是国际上常用的经典的继发性高血压动物模型，在目前筛选降压药物中选用较多[6]。两者相比，SHR大鼠心功能较RHR大鼠低；RHR大鼠肾组织肾素、血管紧张素Ⅱ(Angiotensin II，Ang II)及醛固酮较高，且肾性高血压大鼠血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)mRNA的表达量较SHR大鼠的低；此外，RHR大鼠还有着窦性心动过缓、肾组织损伤等特点[7-9]。本课题组在采用RHR和SHR进行研究时发现，两者血压均呈上升趋势，但是SHR大鼠的血压上升的更高、更快。RHR大鼠血压不稳定，偏差大，造成这种现象的原因可能是因为左肾动脉结扎导致该侧肾脏缺血，而另一侧肾脏不触及。在本次研究中，我们发现天麻芎苓止眩片能够降低两种大鼠模型的收缩压和舒张压；能够明显的减小SHR大鼠的LVMI值，但对RHR大鼠的效果不明显；对于心肾功能，其可以很好的改善RHR的心肾功能，对SHR大鼠具有改善作用，但无统计学差异，可能是因为SHR大鼠早期的肾损伤不明显。

长期处于高血压状态下，易导致患者心、脑、肾、血管等多靶点、多器官器质性病变和功能性损害[10-11]。中医药防治高血压病及其并发症立足于整体辨证论治，可对其多环节、多途径、多靶点进行调节，在降低血压、减轻或逆转靶器官损害、防止严重并发症、改善临床症状及提高患者生活质量等方面均具有较好的作用[12-15]。本实验使用的中药天麻芎苓止眩片是由天麻、川芎等中药组成的复方，具有平肝熄风、清热活血、利湿化痰的功效，临床上主要用于治疗高血压病，眩晕耳鸣，头痛头胀等证者。研究发现，天麻的主要有效成分天麻素能够改善其大中动脉管壁弹性[16]，改善血管内皮功能，抗脂质过氧化损伤，降低血压等[17-18]；其地上部分能够减慢心率使心输出量减少，从而使动脉血流量降低，降低RHR血压[19]；此外，还有研究发现，天麻素可以改善心肌缺血/再灌注损伤从而保护心肌细胞[20]。川芎主要有效成分川芎嗪能够显著增加肾血流，延缓慢性肾损害；抑制血管内皮细胞的分泌乳酸脱氢酶及丙二醛，减轻血管内皮细胞的损伤程度；降低血压[21]。通过本实验发现天麻芎苓止眩片对SHR大鼠及RHR大鼠均具有良好的降血压药理效应，且能够减少心、肾、血管等靶器官的损害，而这种改善作用可能是通过川芎的肾保护作用，天麻的心肌细胞保护作用及改善大中动脉管壁弹性作用等不同中药的综合药理作用来实现的，体现了中医药改善靶器官损伤治疗高血压的优势。

综上所述，天麻芎苓止眩片对两种不同高血压大鼠模型均具有良好降压药理效应。能够将脉压差保持在一定的范围，具有持续稳定的调控血压的药理作用。对高血压模型大鼠的心、肾靶器官损伤具有一定的保护作用，对中医药防治高血压病临床和实验研究具有重要的指导意义。