动物性产品中硝基咪唑类药物残留检测研究进展

刘得贵 张应龙 杜国辉 孟范永

（①山东省临沂市兰山区农业农村局 276000 ②山东商业职业技术学院 山东 济南③山东省东营市畜牧兽医局）

硝基咪唑类药物具有很强的抗厌氧菌作用，可用于防治禽类的球虫病、组织滴虫病及六鞭虫病等，很受养殖户的青睐，但其在动物产品中的药物残留对食品安全构成了直接威胁。此类药物在鸡蛋中的残留以及代谢物的状况尤其另人担忧，目前国家相关政策文件规定不准以促进动物生长为目的在所有食品动物饲养过程中使用。但由于相关研究不够深入和透彻，此类药物在动物体内(尤其是蛋鸡)残留及代谢情况目前尚不清楚，相关检测标准不尽完善，甚至没有相关代谢物的检测标准。硝基咪唑类药物残留检测研究进展旨在对在不同动物性产品中药物残留检测方法进行综述，以期引起研究人员的重视，对此类药物的残留及代谢情况予以详细研究，在相关标准的制定等方面起到一定的效果，制定相关标准以指导用药。

硝基咪唑类药物具有硝基咪唑环结构，这一类化合物包括甲硝唑(MNZ)、二甲硝咪唑(DMZ)、异丙硝唑(IPZ)、塞可硝唑(SCZ)、奥硝唑(ONZ)、替硝唑(TNZ) 、洛硝哒唑(RNZ)等。这类药物能够杀菌、抗原虫，并且对厌氧菌有很强的杀灭作用[1]。其中甲硝唑除以上作用外，还对以下菌群有良好的抑制作用，比如脆弱拟杆菌、产气荚膜梭状芽抱杆菌、以及黑色素拟杆菌梭状杆菌属等；二甲硝咪唑不仅能抑制大肠弧菌、葡萄球菌、链球菌、多型性杆菌等，并能对组织滴虫、阿米巴原虫、纤毛虫等原虫具有很好的杀灭作用[1]。此类药物添加于饲料中，可预防仔猪下痢(要由螺旋体引起)，可防治禽球虫病、六鞭虫病以及组织滴虫病等，此外，使用此药物对动物体重还具有增加作用[1]。因此，此类药物目前在市面上，大受养殖户、经销商等的青睐。但是，也有研究表明具有完整咪唑环的硝基咪唑类药物及其代谢物具有致癌、致突变作用，含有的硝基杂环具有细胞诱变性，有致癌性和潜在的致畸性。甲硝唑类药物中的硝基杂环除具有细胞诱变性以外，其在生物体内的代谢产物羟基甲硝唑(MNZ, MNZOH的代谢物)和羟基二甲硝咪唑(DMZ、HMMNI和RNZ的共同代谢物)与原药具有类似毒性，如果任其在动物源性食品中残留，则会对食品安全构成严重威胁[2]。因此，我国已将这类药物列入《食用动物禁用的兽药及其它化合物清单》中。在欧盟，分别在1993年、1995年和1998年禁止RNZ、DMZ和MNZ这3种药物用于食用动物；在美国，2002年，美国食品与药物管理局(FDA)公布了在进口动物源性食品中禁止使用包括DMZ等硝基咪唑类药物在内的共11种药物；在我国，农业部和国家药品监督管理局明确在第227号公告中规定，不准以促进动物生长为目的，在所有食品动物饲养过程中使用MNZ、DMZ及其盐、酯及制剂[3]。

随着我国史上最强食品安全法的出台，国家对兽药残留的监控更加严格，在畜产品的生产环节，涉及到人体使用的药品被逐渐禁止。但是，作为畜产品养殖过程中的治疗用药，以及以其他目的使用此药物，都有可能导致该类药物在动物性食品中残留，因此，如何准确同步测定动物组织、产品及排泄物中药物残留及代谢物残留状况对人类食品安全至关重要。本文就硝基咪唑类药物在不同动物性产品中药物残留及代谢物测定情况进行了综述。

1 硝基咪唑类药物的检测方法

（1）迄今为止，国内外对于硝基咪唑类药物的检测均有大量报道，研究的检测方法多是针对可食性动物产品、动物组织以及动物排泄物，还包括动物所用饲料。在饲料中的测定方法可以追溯至20世纪80年代左右，硝基咪唑开始作为兽药或促生长添加剂的时后，气相色谱法较少，大部分为高效液相色谱法[4]。但高效液相色谱法灵敏度低，容易被杂质干扰，无法准确定性；气相色谱质谱方法前处理繁琐，干扰因素也较多，适用范围不够宽；目前逐渐处于淘汰当中；LCMS/MS法由于灵敏度高，而且抗干扰性强，目前在硝基咪唑类药物多残留的检测中被广泛应用[5]。（2）随着食品安全问题越来越受重视，检测仪器的飞速发展，高效液相色谱质谱联用技术由于具有仪器的精密性、检测结果的准确性，处理受到人为因素减少等优势，逐渐成为热点的检测方法，其他方法逐渐成淘汰趋势；除此之外，由于快速检测的需要，酶联免疫法测定硝基咪唑类药物残留等食品快速检测方法也有了长足的进展。这两种方法被用来对不同动物性产品中的硝基咪唑类药物残留进行检测，但快速检测方法的准确度仍不能和高效液相色谱质谱联用方法相比拟。

2 硝基咪唑类药物残留在不同动物性产品中检测进展

硝基咪唑类药物残留在不同动物性产品中的检测，目前许多学者已经开展了很多不同检测方法的研究，主要有：李小桥等建立超高效液相色谱-串联质谱法Uplc-MS/MS测定了牛肉中地美硝唑、甲硝唑、洛硝唑和替硝唑残留量。样品前处理为乙酸乙酯提取，用正己烷浸提除脂，亲水亲脂平衡柱萃取净化，以C18反相色谱柱为分析柱，0.1%甲酸水-乙睛为流动相，采用电喷雾电离源(ESI+)对样品分析。结果显示，回收率、线性范围均较好，定量限也较低，从而实现对牛肉中4种药物的检测[5]。王扬等建立了一种同时测定罗非鱼肌肉中甲硝唑、奥硝唑、地美硝唑、洛硝哒唑、替硝唑这5种药物的残留量的反相高效液相色谱法。前处理方法为：水产品肌肉组织经匀浆，加氯化钠、磷酸氢二钾和乙酸乙酯振荡提取浓缩，残余物加盐酸和乙酸乙酯溶解，正己烷去脂后过MCX柱，2%浓氨水甲醇溶液洗脱，色谱柱分离酸氨缓冲液-乙腈(86：14，V/V)为流动相，320nm紫外检测。结果显示：测定肌肉组织中5种硝基咪唑类药物的最低检测限均为1.0μg/kg，在2.0μg/kg的加样水平下，5种药物在罗非鱼中的回收率最低为62.9%，每一种的标准偏差均不大于10%，其灵敏度，准确度和精密度均符合我国农业部兽药残留分析方法的要求[6]。励炯等建立了水产品中硝基咪唑类药物残留及其代谢产物的检测方法，分散固相萃取净化/高效液相色谱-串联质谱法。使用分散固相萃取技术前处理，省去了浓缩、固相小柱萃取等步骤。具体方法为：样品经含0.1%氨水乙腈提取，加无水硫酸钠、Cm-N以及NH2-PSA净化剂后涡旋振荡对样品进行提纯，以甲醇甲酸水溶液为流动相，C18色谱柱分离，梯度洗脱，电喷雾电离质谱检测。结果显示：在优化实验条件下，5种硝基咪唑类药物在20～500mg/L范围内线性关系良好。适用于水产品中5种硝基咪唑类药物残留的检测，可满足水产品质量监测需求[2]。Huet A C等用直接竞争性酶联免疫吸附测定方法检测了鸡蛋和鸡肉中甲硝唑(MNZ)含量，使用抗体显示出与二甲硝咪唑(DMZ)，罗硝唑(RNZ)，羟基二甲硝唑(DMZOH)和异噻唑(IPZ)的交叉反应性。用乙腈提取鸡蛋和鸡肉肌肉样品，并用己烷洗涤除去脂肪。结果显示：甲硝唑、二甲硝唑、罗硝唑、羟基二甲硝唑和异噻唑在检测限极低情况下均能检出[7]。Kanda,Maki等利用LC/MS/MS开发了一种快速有效的测定蜂蜜中的四种硝基咪唑(即二甲硝咪唑，异噻唑，甲硝唑和罗硝唑)和三种亲水代谢物(即2-羟甲基-1-甲基-5-硝基咪唑，1-甲基-2-(2'-羟基异丙基)-5-硝基咪唑和1-(2-羟乙基)-2-羟甲基-硝基咪唑的方法。此方法前处理快速(约30min)，使用较少的有机溶剂，应用QuEChERS(快速，简便，廉价，有效，坚固，安全)程序进行对硝基咪唑的检测分析。此方法7种硝基咪唑的总回收率为76.1%～98.5%；在0.1～0.5mug/kg范围内线性关系良好[8]。WANG Yang等建立了高效液相色谱(HPLC)法同时分析罗非鱼肌肉组织中5种硝基咪唑多残留物(甲硝唑，二甲硝咪唑，奥硝唑，替硝唑和罗丹唑)的样品。将样品均质化并加入氯化钠，磷酸一钾萃取。然后，回收有机相并浓缩。最后，将残余物溶于盐酸/乙酸乙酯中，加入正己烷通过液-液萃取脱脂，在MCX柱上用2%洗脱进行净化。氨/甲醇，色谱分离，乙酸盐缓冲溶液/乙腈(86：14，V/V)为流动相，检测波长为320nm。结果表明，5种硝基咪唑的检出限均为1.0μg/kg，回收率以及线性良好[9]。W Han等开发了一种基于单克隆抗体的间接竞争酶联免疫吸附试验(ic-ELISA)酶联免疫试剂盒，可同时测定动物性组织和饲料中的硝基咪唑类兽药，样品制备方法简单的，甲硝唑，二甲硝咪唑，奥硝唑，替硝唑，洛硝哒唑的含量检测可达到微克级别，在动物组织中的含量回收率在75.5%～111.8%之间，相关性良好[10]。Guo X C等利用对不同硝基咪唑类药物的分子印迹固相萃取技术。此方法用于蜂蜜样品中的硝基咪唑类药物检测。不同硝基咪唑类药物的定量限为1.0μg/kg，结果良好[11]。Mitrowska等利用改进的分子印迹固相萃取前处理方法，建立了选择性测定蜂蜜中14种硝基咪唑及其羟基代谢物的液相色谱-串联质谱联用检测方法。具体为：C-18柱分离，使用0.1%甲酸的乙腈溶液和0.1%甲酸水溶液的梯度洗脱。该方法适用于甲硝唑、羟甲硝唑、二甲硝唑、罗丹唑、羟基二甲硝唑、异噻唑、羟基咪唑、卡那唑、甲硝唑、尼莫唑、奥硝唑、二硝唑、三硝唑和替硝唑。该方法测定硝基咪唑及其羟基代谢物低于推荐的浓度水平3μg/kg。检测线可分别低至0.110～0.387μg/kg和0.179～0.508μg/ kg，且方法稳定性较好。该方法已成功应用于各种蜂蜜样品的分析[12]。Boison等开发了一种新的灵敏的多残留方法(MRM)，通过LC-MS/MS检测，用于筛选，测定和确定浓度≥0.05ng的火鸡肌肉组织中7种硝基咪唑及其3种代谢物的残留物。前处理为用碱金属盐将化合物萃取到溶剂中，然后通过固相萃取(SPE)进行样品净化和浓缩，并通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)定量化合物，确定了新方法的重复性，选择性，耐用性，稳定性，定量水平和确认水平等特征参数[13]。Chi Z 等合成了2-甲基-5-硝基咪唑半抗原，用于制备免疫抗原和包膜抗原，用抗原制备2-甲基-5-硝基咪唑常见抗体，建立了5种硝基咪唑的ELISA检测方法。结果表明：制备了滴度为1：100000的抗血清，同时检测动物源食品中硝基咪唑多残留的ELISA，回收率为85.65%～108%，检出限低至1.9×10～4mg/L。该研究为动物源性食品中兽药残留的快速检测提供了技术基础[14]。Fang C等建立了高效液相色谱结合共振瑞利散射的新型高灵敏度方法，用于测定蜂蜜中的硝基咪唑残留，包括甲硝唑(MNZ)，奥硝唑(ONZ)和咪唑(TNZ)。在pH3.8 BR缓冲溶液中，通过HPLC分离3种硝基咪唑类药物，并对柱后衍生的实验条件进行了优化，在最佳实验条件下，3种硝基咪唑类药物的检出信号随着其浓度在相应线性范围内的增加而增强[15]。Zi-Tong Z等采用加速溶剂萃取法，用乙酸乙酯萃取样品，凝胶渗透色谱纯化。实验条件为安捷伦Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(2.1mm×100mm，3.5μm)，流动相由0.15%甲酸溶液(A)-甲醛(B)组成，采用正离子模式运行质谱仪，同位素内标进行定量分析。结果：相关系数为0.9961～0.9982，方法检出限为1.5μg/kg，定量限为5.0μg/kg。结论：所建立的方法在定性和定量分析中被证明具有高度自动化，高灵敏度和准确性[16]。Rúbies, A.等提出了一种高通量验证方法，用于分析肌肉样品中的11种硝基咪唑。前处理使用乙腈萃取，此方法有效简单，大多数回收率在65%～101%之间，并且不需要清除萃取物。在MRM模式下使用UPLC-QqQMS进行色谱分析，其中电喷雾源以正模式操作。总色谱分析时间为12min。该方法目前用于肌肉样品的分析，并已在其他动物来源，如肾和蛋中进行测试，效果良好[17]。

3 结语

综合以上研究进展可以看出，在硝基咪唑类药物残留检测方面，许多学者已经做了大量的工作，有快速检测的方法，有液相检测方法以及液质联用检测方法等，前处理采取的方法也均有其新意及可取之处，除了提取的溶剂不相同外，具体的操作步骤也不尽相同。通过检测基本都取得了一定的满意效果。但是通过所有进展，我们看出，所有的方法均是针对硝基咪唑类药物残留展开的，由于硝基咪唑类药物在动物体内进行代谢，关于代谢产物的情况以及危害不明，对于代谢产物的检测更无从谈起。针对蛋鸡的养殖，目前根据国家相关法规及规定，能够合法使用的兽药越来越少，且能够使用的兽药都要严格的条件限制。但是，在鸡蛋中硝基咪唑类药物残留以及代谢物检测仍未有相关方法的出现，同时国家尚未制定出此类药物在鸡蛋中残留检测方法标准，许多不法分子瞄准了在蛋鸡养殖过程中饲喂此类药物，从而规避市场因兽药残留检测不合格带来的处罚风险。因此，此类药物在鸡蛋中的残留以及代谢物的状况引人担忧。为此，对硝基咪唑类药物残留检测应该关注其在动物体内代谢产物的情况，这将是未来咪唑类检测的研究方向，加强对此类药物及其代谢物残留情况的研究，以及对其检测方法做详细的标准化的研究，都具有重要的现实意义。