抑制COTE1表达对多柔比星诱导的肝癌细胞凋亡的影响

朱津，张海，徐三荣

(江苏大学附属医院普外科，江苏 镇江 212001)

肝细胞肝癌是肝脏原发性恶性肿瘤中最为常见的一种类型，具有发展隐匿、进展迅速、复发容易、预后不佳等特点，患者确诊时多为晚期[1]。目前，针对肝癌的治疗方法仍然以外科手术进行局限性切除为主，但由于肝癌的特殊性，往往只有部分患者符合肝脏肿瘤手术切除指征，因此，化疗成为治疗肝癌的重要手段[2]。多柔比星是临床上常用的高效性广谱化疗药物之一，长期使用易使肿瘤细胞产生明显的耐药性，致化疗效果降低，严重影响肝癌患者的生存和预后[3]。COTE1基因，即人FAM189B基因(family with sequence similarity 189 member B)，广泛表达于心脏、肝脏、肺等多个脏器[4]。有研究表明，COTE1能通过与WWOX(WW domain-containing oxidoreductase)相结合参与肝癌细胞的凋亡过程，影响肝癌细胞的增殖与转移[5-6]，而WWOX又能够通过凋亡途径来逆转肺癌、骨肉瘤等细胞的耐药，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[7-8]。但是，COTE1在肿瘤细胞耐药中的作用尚不清楚，因此，本研究拟探讨COTE1对肺癌细胞凋亡水平的影响，揭示COTE1在肝癌细胞耐药中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人肝癌PLC/PRF/5细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院；COTE1短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)慢病毒表达载体购自苏州吉玛基因有限公司；MEM(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；多柔比星(大连美伦生物技术有限公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学公司)；RIPA裂解液、cocktail蛋白酶抑制剂(美国Sigma公司)；羊抗人COTE1抗体(美国Santa Cruz公司)；GAPDH抗体、β-肌动蛋白、驴抗羊二抗、兔抗小鼠二抗、嘌呤霉素、ECL试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物公司)；Annexin V-Alexa647 fluor/PI凋亡试剂盒(南京福麦斯生物公司)。

1.2 细胞培养

人肝癌细胞株PLC/PRF/5培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的MEM中，置于37 ℃、5%CO2恒温孵育箱内，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 慢病毒转染及稳转细胞株的构建

将PLC/PRF/5肝癌细胞分为shRNA组和对照组，分别接种于6孔板；次日细胞汇合度达30%～50%时，shRNA组加入(1～2)×106/U慢病毒和2 μL多聚赖氨酸，使终浓度为5 μg/mL；24 h后换液；48 h后于荧光显微镜下观察感染效率；加入0.1 μg/mL嘌呤霉素进行细胞筛选。对照组加入相同浓度的无关序列慢病毒，其余处理同shRNA组。shRNA组慢病毒靶序列：5′-GTATGTAAGCCTTCAATAA-3′，对照组慢病毒靶序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.4 实时荧光定量PCR检测COTE1 mRNA表达

收集相应处理后的细胞，按照说明书提取各组细胞总RNA，再经过反转录合成cDNA模板，最后进行荧光定量PCR检测。扩增条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环，95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s收集荧光。引物序列：COTE1上游引物 5′-GGGCTCTGACCTAGGCTTCT-3′、下游引物5′-ACAGAAGCTCTCCCAGTCCA-3′；β-肌动蛋白上游引物5′-AGAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下游引物5′-CTGGGCCTCGTCGCCCACATA-3′。扩增结果采用ΔΔCt法计算相对定量。

1.5 蛋白质印迹检测COTE1蛋白表达

收集相应处理后的细胞，用预冷PBS清洗3次；每孔加入100 μL RIPA细胞裂解液和1 μL cocktail蛋白酶抑制剂，冰上裂解30 min；用细胞刮刀刮取细胞，4℃行13 000 r/min离心15 min；取上清液，BCA法测蛋白浓度。总蛋白行10% SDS-PAGE，湿转1.5 h至PVDF膜；用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h；加入羊抗人COTE1抗体(1 ∶200)、GAPHD抗体(1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次10 min；加入相应的HRP标记的二抗(1 ∶5 000)室温孵育1 h；再洗膜3次；采用ECL化学发光试剂显色。

1.6 CCK-8法检测细胞抑制率

将shRNA组及对照组细胞分别以每孔1×104个接种于96孔板，待细胞贴壁后，加入不同浓度的多柔比星(终浓度为0，0.125，0.25，0.5，1.0 μg/mL)培养48 h；每孔加入10 μL CCK-8试剂，培养2 h；用酶标仪检测D(450 nm)值；每个浓度设置3个复孔。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡率

将shRNA组及对照组细胞分别以每孔2×105个接种于6孔板中，各设3个复孔，待细胞贴壁后，加入多柔比星使终浓度为0.25 μg/mL，培养48 h；按照Annexin V-Alexa Fluor647/PI凋亡试剂盒说明步骤收集细胞，进行流式细胞术检测。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 慢病毒转染

慢病毒转染细胞并经过0.1 μg/mL嘌呤霉素筛选1周后，荧光显微镜下几乎全部细胞均可见绿色荧光，提示慢病毒转染成功。见图1。

图1 荧光显微镜下荧光蛋白的表达(200×)

2.2 慢病毒感染后肝癌细胞中COTE1 mRNA及蛋白的表达

实时荧光定量PCR显示，shRNA组COTE1 mRNA表达较对照组显著降低(t=10.329，P<0.05)；进一步蛋白质印迹结果显示shRNA组COTE1蛋白表达也明显降低(t=3.459，P<0.05)，见图2。由此表明，shRNA组的目的基因COTE1被抑制，可进行后续实验。

图2 实时定量PCR和蛋白质印迹法检测COTE1-shRNA的干扰效果

2.3 COTE1-shRNA对肝癌细胞增殖的影响

CCK-8检测结果显示，肝癌细胞经慢病毒感染后，多柔比星对细胞的增殖抑制率明显高于对照组(P<0.05)，且呈浓度依赖性。见图3。

*：P<0.05

2.4 COTE1增强多柔比星对细胞凋亡的诱导作用

流式细胞术检测结果显示，经多柔比星处理后，shRNA组细胞凋亡率较对照组明显升高(t=-4.038，P<0.05)，见图4。由此表明，抑制COTE1表达可促进肝癌细胞凋亡。

3 讨论

文献表明，慢病毒载体具有转染率高，持续时间长等优点，能实现目的蛋白长期、稳定的有效表达[9]。本实验通过将携带有COTE1基因干扰序列的慢病毒载体感染肝癌PLC/PRF/5细胞，并在嘌呤霉素的筛选下得到COTE1基因稳定沉默表达的细胞，最后验证目的基因COTE1表达被显著抑制。

图4 流式细胞术检测两组肝癌细胞株的凋亡率

既往研究发现，癌基因在耐药细胞株中表达较亲本细胞升高或降低，而利用反义寡聚核苷酸下调这些基因的表达，促进凋亡蛋白或凋亡通路因子的激活，能够增强肿瘤的化疗增敏作用。如通过干扰大肠癌SW480细胞中HSPA27表达，能够提高5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞的促凋亡作用，增强细胞对化疗药物的敏感性[10]。本实验研究结果表明，与对照组相比，不同浓度多柔比星处理后shRNA组细胞的增殖抑制率均明显升高，表明抑制COTE1表达能够增强多柔比星对肝癌细胞的化疗作用。同时，多柔比星处理后的细胞凋亡率也明显高于对照组，提示COTE1能够通过促进细胞凋亡来增强化疗药物的抗肿瘤效果，逆转细胞耐药，但其通过何种途径，有待进一步实验研究。

综上所述，抑制COTE1表达能够增强肝癌细胞对多柔比星的化疗敏感性，逆转肝癌细胞耐药。