替格瑞洛对大鼠心肌梗死再灌注后心律失常及钙离子通道影响

蔡青青，丁超，高亚松，聂蔚卓，苏岩岩

心肌缺血再灌注损伤（MIRI）是指短时间内心肌血供中断，在一定时间内恢复血供后，原缺血心肌发生较缺血时更为严重的损伤[1]。再灌注损伤将严重影响患者的预后，它已成为现代冠心病领域的预防和治疗的焦点。替格瑞洛是一种环戊基三唑嘧啶，作用于血小板P2Y12受体的拮抗剂。该药物本身为活性前体，进入体内后能够直接转化为具有抗血小板作用的活性形式。许多研究说明，替格瑞洛可明显降低缺血再灌注损伤，但替格瑞洛是否有电生理学效应，目前的报道不多。本研究采用全细胞膜片钳技术，研究替格瑞洛对缺血再灌注后SD大鼠心室肌细胞跨膜钙离子通道电流的影响，探讨替格瑞洛拮抗再灌注心律失常的细胞学离子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物实验选用健康雄性SD大鼠，体质量280～320 g，由河北医科大学实验动物中心提供（合格证号：710293）。

1.2 实验分组采用随机区组法将大鼠分为3组，每组各8只。①假手术组（sham组）：只穿线不结扎。②心肌缺血再灌注动物模型组（I/R组）：结扎左前降支30 min，再灌注120 min；③替格瑞洛组（ticagrelor组）：结扎术前2 h给SD大鼠灌胃替格瑞洛20 mg/kg。

1.3 心肌缺血再灌注（I/R）动物模型建立用浓度25%的乌拉坦0.5 mg/100 g腹腔注射麻醉大鼠，将针刺电极插入动物左下肢、右上肢皮下记录肢体导联心电图。大鼠颈部切开1 cm左右的创口，用镊子钝性分离，暴露气管，切开气管，行气管插管，连上小动物呼吸机，进气量为1～1.5 ml/100 g，呼吸频率为80～90 次/min。接着在大鼠胸骨旁约1 cm处，在第二、三肋间用剪刀剪开约2 cm的创口，用镊子钝性分离，剪开心包膜，暴露心脏，确认左前降支的位置，左前降支的位置从主动脉根部发出的，并把它分离出来，接着用3/8圆2.5×8不锈钢圆针，带5-0号丝线穿过左前降支，大约于左心耳下缘2 mm处穿针，进针深度大概1 mm，宽度大概1.5 mm，在肺动脉圆锥旁出针，接着丝线穿过一塑料套管，约1.5 mm高，在线的一端用主动脉夹夹上，形成一个闭合线路，线路中间用撑胸器撑开，给予前降支压迫，使其缺血，压迫30 min后，将撑胸器取出，压迫解除，缺血心肌恢复血流，即心肌开始再灌注。再灌注120 min。模型制备成功的标志是心电图上出现Ⅱ导联ST段抬高的改变，压迫的心肌因缺血变得苍白。压迫接触后，心肌恢复血流，开始再灌注，心肌由苍白变得红润，在开始灌注的时候，会出现再灌注心律失常。在建立大鼠心肌缺血再灌注模型过程中，一直记录心电图，观察大鼠心肌再灌注后出现的室性期前收缩、室性心动过速及室颤等心律失常情况，心律失常诊断标准按照Lambeth会议标准[5]，评分采用Curtis-Walker评分规则[6]，对心律失常严重程度进行定量分析。

1.4 心室肌细胞的分离大鼠心肌缺血再灌注20 min后，迅速开胸，用剪刀剪下大鼠的心脏，然后把心脏放在冰过的无钙台式液里，修剪心脏后，将主动脉套在灌流套管上，用0号线固定好，接下来，把心脏悬挂在Langendorf灌流系统上经主动脉逆行灌流。用无钙台式液灌流心脏约5 min，直到心脏停跳之后，再换酶液（30 ml的无钙台式液中含15 mg的胶原酶Ⅱ），循环灌流15～18 min，待心脏变得松软，摘下心脏放在KB液中，把左心室剪碎，用粗头的吸管轻轻反复吹打，用无菌的200 μm滤网过滤之后，将收获的心室肌细胞室温静置使存活心肌细胞沉降，更换新鲜KB液，室温静置40 min后进行实验。选取条纹清晰的心室肌细胞作为研究对象，进行下一步膜片钳实验。

1.5 膜片钳全细胞记录按Hamill法进行[7]，在玻璃微电极内充满内液。玻璃微电极电阻2.5～3.0GΩ。将玻璃微电极连在装电极的装置。之后用吸管吸取上述静置40 min的心室肌细胞数滴滴入灌流槽中。之后把灌流槽放在显微镜下，2 min后，细胞沉到灌流槽底，用钙外液灌流，冲去已经死亡的细胞碎片。在显微镜下选取表面光洁，纹路清晰的心室肌细胞为实验研究的对象。使用三维液压微操纵器操纵电极靠近细胞，进行封接，达到1GΩ以上，吸破心室肌细胞膜，形成全细胞记录。所有实验在室温（20℃～25℃）下进行。

1.6 心肌细胞L型钙电流的记录应用全细胞膜片钳技术在室温（20℃～25℃）下记录心室肌细胞的L型钙通道，心室肌细胞L型钙电流。心室肌钙电流采用电压钳的方法进行记录，所拉制的电阻为1.5～2.5MΩ。ICa-L电极外液（mM）：TEA-Cl 140，MgCl22，HEPES 10，Glucose 10，CaCl21.8，用CsOH调pH值为7.4。ICa-L电极内液（mM）：CsCl 120，TEA-Cl 20，HEPES 10，EGTA 10，用CsOH调pH值为7.2。ICa-L记录：激活程序：从维持电压（HP）-40 mV，阶跃+5 mV，逐步去极化到+60 mV，时程300 ms。以不同钳制电压下的ICa-L密度绘成电流-电压（I-V）曲线。失活程序：采用双脉冲刺激法，HP为-50 mV，条件脉冲-80 mV -+40 mV，钳制时间500 ms，阶跃+10 mV，每次条件脉冲后紧跟一固定的去极化到+10 mV的测试脉冲，持续时间250 ms，将记录到的L型钙电流与最大激活时的L型钙电流作对比，与相应的条件脉冲膜电位作图得钙通道失活曲线。ICa-L幅值以内向电流峰值与100 ms后的电流值之差计算。

1.7 统计学处理所有数据均采用SPSS 13.0统计学软件分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示组间比较采用方差分析。以P＜0.05为显著性差异的指标。

2 结果

2.1 替格瑞洛对缺血再灌注心律失常的影响假手术组仅出现少量室性期前收缩（2.1±1.25次），未发生室性心动过速及室颤，心律失常评分0.50±0.19分；与假手术组相比，I/R组室性期前收缩发生率、室性心动过速和室颤持续时间、室性心动过速和室颤发生率以及心律失常评分均明显增加（P均＜0.05）；与I/R组相比，ticagrelor组室性期前收缩发生次数、室性心动过速持续时间、室性心动过速发生率以及心律失常评分明显降低（P均＜0.05）（表1，图1）。

表1 各组大鼠心律失常发生情况的检测结果

图1 四种类型的心电图

2.2 替格瑞洛对缺血再灌注后L型钙通道的影响假手术组的L型钙通道的峰值电流密度为（-4.3±0.5 pA/pF，n=15），半数激活电压为（-14.6±0.8 mV，n=15），半数失活电压为（-26.0±1.1 mV，n=10）。与假手术组相比，I/R组L型钙电流密度明显增高（峰值电流密度为-9.4±0.6 pA/pF，n=15，P＜0.05），I/R组不影响L型钙通道的激活过程（半数激活电压为-13.1±0.7 mV，n=15 ，P＞0.05），I/R组明显减慢心肌缺血再灌注L型钙通道的失活过程（半数失活电压为-22.7±0.8mV，n=14，P＜0.05）；与I/R组相比，ticagrelor组的L型钙电流密度明显降低（峰值电流密度为-7.1±1.0 pA/pF，n=9，P＜0.05），ticagrelor组不影响L型钙通道的激活过程（半数激活电压为-13.7±0.7 mV，n=9，P＞0.05），与I/R组相比，替格瑞洛明显加快心肌缺血再灌注L型钙通道的失活过程（半数失活电压为-25.7±0.6 mV，n=9，P＜0.05）。（图2示3组细胞典型的L型钙电流形态曲线；图3示替格瑞洛对L型钙通道电流密度的影响；图4示替格瑞洛对L型钙通道激活过程的影响；图5示替格瑞洛对L型钙通道激活过程的影响） 。

图2 3组细胞典型的L型钙电流形态曲线

图3 替格瑞洛对L型钙通道电流密度的影响。（A） L型钙电流的电流电压曲线（B）L型钙电流的峰值电流密度

3 讨论

图4 替格瑞洛对L型钙通道激活过程的影响

图5 替格瑞洛对L型钙通道失活过程的影响。（A）替格瑞洛对L型钙通道稳态失活曲线（B）L型钙通道稳态失活曲线的V1/2值

心肌再灌注损伤是指因血流突然中断而缺血的心肌的部分或全部在血流恢复供应时所产生的损伤。尤其是再灌注心律失常，是缺血再灌注期患者猝死的一个重要原因。临床上抗心律失常药物通常直接作用在阻断某一种离子通道上，但这些作用通常对室性快速心律失常疗效欠佳。

P2Y12受体拮抗剂对急性心肌梗塞患者血小板聚集抑制和动脉粥样硬化血栓形成的预防起着重要的作用[8]。而替格瑞洛是一种新型的P2Y12受体拮抗剂，其抗血小板作用比氯吡格雷速度更快、作用更大、性质更稳定[2]。国内外的基础及临床研究表明，替格瑞洛可能会增加腺苷的血浆浓度，可能是通过1型平衡型核苷转运体抑制细胞摄取腺苷，导致腺苷的血浆浓度增加[9,10]。

再灌注损伤的原因尚不明确，可能与Ca2+超载有关。本研究发现，替格瑞洛可降低心肌缺血再灌注期间室早的发生次数、室速及室颤的持续时间及发生率。心肌缺血再灌注后，L型钙电流明显增高，替格瑞洛可使增高的L型钙电流下调，逆转电重构，可能为替格瑞洛防治再灌注失常的细胞学离子机制。替格瑞洛可能通过两条途径发挥抗心律失常作用：一方面通过钙拮抗作用，提高室颤阈，增加细胞膜的稳定性；另一方面，通过非抗血小板的作用，引起循环血液中的腺苷浓度的增加。腺苷浓度的增加，可以对再灌注损伤起保护作用。有研究表明，经皮冠状动脉介入术后的患者应用腺苷治疗，心肌梗死面积可减少。敲除平衡型核苷转运体（ENT）的小鼠也可减少再灌注后心肌梗死面积。外源性腺苷输入到血管，可抑制ENT，从而引起内源性腺苷浓度的增加，从而发挥保护心脏作用。腺苷能够阻抑嗜中性粒细胞的活化，防止内皮细胞损伤。也许腺苷的这种作用机制在心肌缺血再灌注损伤中起的作用很重要。但目前仍未阐述清楚腺苷对心肌保护作用的机制。

由于替格瑞洛对1型平衡型核苷转运体的亲和力及血清蛋白的强结合力，具有促进红细胞ATP释放和抑制红细胞摄取腺苷的联合作用，可提高患者循环血液中局部腺苷的浓度，从而可产生相关的临床作用。而目前，腺苷介导模式的作用在何种程度上有助于替格瑞落的临床获益尚未阐述清楚，还需要进一步的研究，以更好的指导替格瑞洛在临床上的使用。