兔曲霉菌性角膜溃疡局部应用两性霉素B脂质体的研究

王瑞娜，郭红亮，朱海峰，高 伟

(西安市第一医院；西北大学附属第一医院；西安市眼科医院；陕西省眼科研究所，陕西西安710002)

真菌性角膜炎是一种严重损害视功能的感染性角膜病变。近年来由于激素、广谱抗生素、免疫抑制剂的广泛应用，器官移植的普遍开展，全身性及局部真菌感染日益增多。曲霉菌感染是我国大部分地区最常见的丝状菌之一。两性霉素B是治疗曲霉菌感染的首选药物。但是一直以来，由于全身应用副作用大，眼部应用生物利用度低，刺激性大，病人依从性差等原因使其在真菌性角膜炎的治疗中受到很大限制。本研究的目的在于观察两性霉素B脂质体(Liposomal amphoterich B,LAmB)局部应用的吸收率和生物利用度，以提高曲霉菌性角膜炎的疗效。

1 材料

1.1 实验仪器

高效液相色谱仪(Waters公司)，Quattro Premier Micromass质谱仪(Waters公司)，Masslynx4.1软件操作系统，CR21F型高速低温离心机(日本日立公司)，TurbovapLV浓缩仪(Zymark公司)。

1.2 药品、试剂及动物

甲醇与乙腈(农残级，TEDIA公司)。白藜芦醇购自中国药品生物制品检定所(纯度>99%)。普通级健康新西兰白兔105只(购自西安交通大学动物实验中心)，雌雄各半，兔龄46个月，体重2.0～3.0 kg。

1.3 实验制剂的准备

1.3.1 0.5%LAmB及0.25%LAmB的制备 用上海新先锋药业公司的两性霉素B脂质体静脉用粉针剂10 mg，加灭菌注射用水2 mL或4 mL，充分混匀，直至呈黄色均匀液体。

1.3.2 0.5%AmB的制备 用华北制药公司两性霉素B静脉用粉针剂25 mg，加入灭菌注射用水5 mL，充分混匀，直至呈黄色均匀液体。

2 实验方法

2.1 动物实验方法

兔眼应用两性霉素B脂质体的实验白兔随机分5个实验组，每组21只；每次实验用一组，再将21只白兔随机分为3组，对每只白兔左眼采用角膜“#”形划痕作兔实验性曲霉菌性角膜溃疡模型，分别应用0.5%LAmB，0.25%LAmB，0.5%AmB点眼，每15 min点眼一次，共4次，每次50 μL，用药后5 min，15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，8 h，取每只白兔房水标本用1 mL注射器在透明角膜周边部斜行穿刺抽取100 μL房水送检，并同时取下角膜组织备用，标本中混有血液的弃用，并补充新的动物。

2.2 房水标本的处理及房水和角膜中AmB的测定

2.2.1 标准曲线的建立 由于房水和角膜片中的内源性物质可对分析结果产生干扰，需要对样品进行预处理。取0.2 mL空白房水液，配制不同浓度的Amphotericin B标准溶液1，10，20，50，200 ng/mL(含内标Resveratrol，10 ng/mL)，混匀，加乙酸乙酯2 mL，涡流混合1 min，3000 r/min离心，提取2次，合并提取液置于尖底试管中，于55℃ N2吹干，残留物加入50 μL甲醇溶解，涡流混合1 min，取10 μL进样，记录色谱图(见封二图1)。以标准液浓度为横坐标，标准物与内标峰面积比值为纵坐标，求得工作曲线回归方程。取空白的角膜片，机械匀浆，制备组织悬液，依照上述同样的处理过程，求得工作曲线回归方程。色谱条件：Waters Symmetry C18色谱柱(50×2.1 mm，5 μm)。流动相：乙腈和0.1%甲酸溶液，流速0.2 mL/min。柱温为30 ℃，进样量10 μL。质谱条件：毛细管电压3.0 kV，源温度为110 ℃，脱溶剂温度300 ℃，锥孔气流50 L/h，脱溶剂气流650 L/h，碰撞气体为氩气，碰撞气流速0.18 mL/min。电喷雾电离负离子方式(ESI+)，多反应监测(MRM)方式检测。

2.2.2 方法学考察 用乙酸乙酯提取房水和角膜片中的Amphotericin B，在质谱检测的过程中，提取基质对药物的离子化没有明显的抑制，效果比较满意。本文建立的样品预处理方法具有挥干速度快、杂质少、提取率高而且稳定的特点。色谱图表明，本研究采用的分析方法具有较好的特异性，而且分析速度快。

2.2.3 标本的保存、处理和检测 房水及角膜标本取得后，放于-80℃的低温冰箱中冷冻保存。

3 结果

3.1 测定房水中AmB的工作曲线回归方程

以待测化合物与内标峰面积比值为纵坐标，待测化合物的浓度为横坐标作图，得工作曲线。Amphotericin B的典型工作曲线回归方程为y=0.0462x-0.0442，γ2=0.9988，n=6，线性范围为1.0～200 ng/mL，最低检测限为0.5 ng/mL(见图2)。

图2 房水样品中AmB的工作曲线回归方程

3.2 测定角膜片样品中AmB的工作曲线回归方程

以待测化合物与内标峰面积比值为纵坐标，待测化合物的浓度为横坐标作图，得工作曲线。AmB的典型工作曲线回归方程为y=0.0393x-0.0152，γ2=0.9989，n=6，线性范围为1.0～200 ng/mL，最低检测限为0.5 ng/mL(见图3)。

图3 角膜片样品中AmB的工作曲线回归方程

3.3 房水及角膜内药物浓度测定

0.5% LAmB、0.25% LAmB及0.5% AmB滴眼液使用5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h及8 h角膜中的AmB浓度结果见表1，房水中的AmB浓度结果见表2。

表1 不同时间点三组兔眼角膜中的药物浓度(μg/mL)

表2 不同时间点三组兔眼房水中的药物浓度(μg/mL)

4 讨论

目前在我国真菌性角膜炎居感染性角膜炎的首位，占感染性角膜炎的62%，我国大陆地区主要病原体为镰刀菌属(64.95%)和曲霉菌属(14.43%)[1]。多烯类是目前常用的抗真菌药物，主要有那他霉素(natamycin，pimaricin)和两性霉素B(AmB)。其作用机制是阻止真菌细胞膜麦角固醇合成，膜的渗透性增加，导致细胞崩解死亡[2]。AmB除了能使细胞膜的通透性发生改变，导致重要的细胞内容物流失而造成菌体死亡，也可通过刺激巨噬细胞调整自体免疫功能产生杀真菌作用，研究表明AmB对常见致病菌属均敏感[3-4]。临床表现上曲霉菌性角膜溃疡中菌丝多呈垂直生长、斜行生长[5]易穿透角膜后弹力层引起严重的虹膜反应和真菌性眼内炎早期就会出现角膜组织的坏死、溶解、穿孔，病情更危重预后极差[6]，因此观察角膜及前房内AmB药物浓度对其疗效有重要的临床需求。

有文献报道，AmB对镰刀菌属、曲霉菌属及念珠菌属的MIC90均为4.0g/mL[7]。本研究观察0.5% LAmB、0.25% LAmB及0.5% AmB滴眼液在角膜及房水中的药物浓度，结果发现30 min内0.5% AmB与0.5%LAmB在角膜中均可达到高于MIC90的药物浓度，而0.25%LAmB则在点药1 h后达到高于MIC90的药物浓度，三组持续时间均长达8h。0.5%LAmB、0.25%LAmB、0.5%AmB滴眼液在房水中检测的药物浓度高于MIC90分别在点药5 min、15 min及1 h后，前两者均可持续至点药8 h，而0.5%AmB滴眼液持续至2 h即下降至MIC90以下。通过以上研究我们发现，0.5%LAmB、0.25%LAmB及0.5%AmB滴眼液在曲霉菌性角膜炎的治疗中均能发挥有效的作用，而LAmB较AmB在房水中的药物浓度更持久。

AmB的抗真菌活性取决于其穿透真菌细胞壁到达细胞膜的能力，其通过与真菌细胞膜上的固醇(主要为麦角固醇)结合，造成膜通透性改变胞内容物流出而使真菌细胞死亡；而AmB也能结合哺乳动物细胞膜中的固醇(主要为胆固醇)，对动物和人类肾脏造成毒性[8]。LAmB是将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊，是一种定时定向药物载体，AmB与胆固醇结合后可进入脂质体的脂质双分子层，并保留在其中，同时脂质体使真菌细胞壁孔隙增加，更利于AmB到达真菌的细胞膜，不仅能降低与人体细胞膜中胆固醇的结合还能增强对真菌细胞麦角固醇的结合，从而发挥AmB的最大杀菌能力[9]。这与研究脂质体包埋AmB增强了对曲霉菌的抗菌作用结果相符[7，10]。

在临床中，由于曲霉菌性角膜炎具有难治、病程长、易反复的特点[11]，因此需早期的频繁点眼并持续较长时间。0.5%AmB因在眼内的半衰期短，局部应用刺激性大，造成患者的依从性降低，与本研究结果其在房水中的药效维持时间较短相符。而LAmB具有眼内半衰期长，药物利用度高，药效持久且局部应用刺激性小[12-14]等特点。另有研究表明0.5% LAmB滴眼液对角膜内皮的毒性要高于0.25%并且随着作用时间的延长而加重[15-16]。依据本研究结果显示，0.25% LAmB滴眼液使用频次3次/24 h即可达到治疗目的，不仅可减少点药次数提高患者依从性，同时也可减少药物对眼表的副作用[17]。因此0.25%LAmB滴眼液是临床工作较安全、有效的药物浓度[18]。

5 结论

LAmB较AmB治疗曲霉菌性角膜炎更安全、有效，且0.25%LAmB具有毒性低、效果好并成本低的优点，但目前尚无0.25% LAmB滴眼液的成品，本试验为临床工作提供了确切的实验学依据。但由于本试验研究时间较短，药物的使用频率是否有更合适的选择，更长时间的药物浓度检测是否有变化，其他不同浓度相关的药物动力学等有待于更进一步研究。