GLP-1对3T3-L1前脂肪细胞增殖及脂联素的影响

邢 英，梅彩霞2，玛依拉·卡哈尔，李雅丽

肥胖是一种多因素引起的慢性代谢性疾病，表现为体内脂肪堆积过多，体重增加[1]。随着人们生活水平的提高和生活方式的改善，肥胖发病率呈逐年上升趋势。据世界卫生组织统计，全球约有3 亿人患有肥胖，占全球人口7%以上[2]。中国成人超重率为22.8%，肥胖率为7.1%[3]。肥胖是许多慢性疾病如糖尿病、高血压、高脂血症、动脉硬化等的主要危险因素，已经成为威胁人类健康的杀手之一[4-5]。脂肪组织是人体重要的储能组织，脂肪细胞出现增殖和分化的异常，将会引发脂肪肝、代谢综合征和心血管疾病等。因此，干预脂肪细胞增殖和分化成为防治上述疾病的关键[6]。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)及其相关药物，因具有改善胰岛素抵抗、降低体重、改善脂代谢等作用，越来越多地被应用于肥胖等相关疾病的治疗中[7]。有研究发现，GLP-1可能通过上调血清脂联素水平，改善糖脂代谢，进而使机体胰岛素敏感性增加[8-9]。本研究运用GLP-1干预 3T3-L1前脂肪细胞，观察其对脂肪细胞增殖以及脂联素的影响，为阐明GLP-1对肥胖过程影响提供前期研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料 3T3-L1小鼠前脂肪细胞系(ATCC品牌)，GLP-1、胰岛素(INSULIN)、地塞米松(DEX)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)购自美国Sigma公司，高糖培养基(DMEM，Hyclon 公司)，10%胎牛血清(FBS，Hyclon公司)，二甲基亚砜(DMSO)购自中杉金桥公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及诱导分化 将3T3-L1前脂肪细胞系加入含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO2条件下培养，待细胞达到完全融合，48 h后开始诱导，换诱导剂Ⅰ：98.74 mL(90%DMEM+10%FBS)，1 mL IBMX(终浓度0.5 mmol/L)，161 μL INSULIN(850 nmol/L)，100 μL Dex(1 μmol/L)。3 d后换诱导剂Ⅱ：99.84 mL(90%DMEM+10%FBS)，161 μL胰岛素(850 nmol/L)，继续培养，每2 d换液1次，至第8天，约90%的细胞呈脂肪细胞表型时行下一步处理。

1.2.2 试验分组及处理 将诱导成功的3T3-L1前脂肪细胞以浓度0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L的GLP-1作用于3T3-L1前脂肪细胞，共同培养至第8天，在培养第2天、第4天、第6天、第8天收集细胞备用，每组均设3个复孔。

1.2.3 细胞计数试剂盒(CCK-8)比色法测定GLP-l对细胞增殖的影响 3T3-L1前脂肪细胞以1×104/mL，每孔100 N，4复孔接种于96孔培养板，在37.5% CO2培养箱中培养12 h后，观察见细胞已贴壁。设对照组(0 nmol/L)和干预组(分别加入终浓度1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L的GLP-1)，细胞共培养8 d，每24 h更换含药培养液1次。第2天、第4天、第6天、第8天经CCK-8比色法应用酶联免疫检测仪测定吸光度(OD)值以代表活细胞数及细胞增殖情况。实验重复3次。

1.2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定3T3-L1前脂肪细胞培养基中脂联素含量 在上述实验步骤基础上，第2天、第4天、第6天、第8天经ELISA法测定细胞上清液中脂联素含量。实验重复3次。

2 结 果

2.1 小鼠3T3-L1前脂肪细胞形态学表现 倒置显微镜下观察：诱导分化前，3T3-L1细胞呈梭形，胞浆内无脂滴，表现为纤维母样的前脂肪细胞形态(圈)。诱导分化4 d后细胞变大、变圆，部分细胞中出现分散的细小脂滴；诱导8 d后，80%左右细胞均分化为成熟脂肪细胞，表现为细胞进一步增大，呈圆形，胞浆内含有大量脂滴，脂滴聚集于核周，形成“戒环”样形态。结果见图1～图3。

图1 诱导第0天3T3-L1前脂肪细胞形态(×20)

图2 诱导第4天3T3-L1前脂肪细胞形态(×20)

图3 诱导第8天3T3-L1前脂肪细胞形态(×20)

2.2 不同浓度GLP-1作用不同时间对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响 应用不同浓度GLP-1干预3T3-L1前脂肪细胞的增殖过程，干预第4天，100nmol/L、1 000 nmol/L较0 nmol/L细胞数量降低(P<0.05)；第6天，100 nmol/L、1 000 nmol/L较0 nmol/L细胞数量降低(P<0.05)；第8天，随着GLP-1干预浓度的增长，细胞数量较0 nmol/L明显降低(P<0.05或P<0.01)。以上结果显示，高浓度长时间GLP-1干预对3T3-L1前脂肪细胞增殖的抑制作用更明显。详见表1。

表1 不同浓度GLP-1对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响(OD值)(±s)

与同时间0 nmol/L比较，1)P<0.05，2)P<0.01

2.3 不同浓度GLP-1作用不同时间对3T3-L1前脂肪细胞培养基中脂联素含量的影响 随着GLP-1浓度的逐渐增高，3T3-L1前脂肪细胞培养液中脂联素含量逐渐升高，呈一定的浓度依赖性(P<0.05或P<0.01)。在相同浓度GLP-1干预下，随着作用时间的延长，脂联素的含量也逐渐升高。详见表2。

表2 不同浓度GLP-1对3T3-L1前脂肪细胞培养基中脂联素含量的影响(±s) mg/L

与同时间0 nmol/L比较，1)P<0.05，2)P<0.01

3 讨 论

近年来，脂肪细胞分化调控及其与肥胖、胰岛素抵抗的关系一直是国内外的研究热点。脂肪组织是一个新型的内分泌组织，其分泌的许多脂肪细胞因子对维持体内代谢平衡有着重要作用。3T3-L前脂肪细胞功能与之相似，广泛应用于脂肪细胞增殖、分化和分化过程中基因表达调控的研究领域，也是研究减肥降脂降糖药物及其作用机制的一个方向[10]。GLP-1是一种肠促胰岛素，和胰岛细胞分泌的胰高血糖素一样源于胰高血糖素原基因，在外周主要以肽的有效形式通过多种途径发挥抗肥胖和其他代谢性疾病的作用[11]。

本研究以3T3-L1前体脂肪细胞为研究对象，探讨GLP-1对其增殖的影响。本研究结果发现，GLP-1对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响随不同浓度、不同作用时间有所不同。主要趋势为随着干预时间的延长，其对3T3-L1 前脂肪细胞的增殖有明显抑制作用，且有剂量依赖关系。本研究中GLP-1浓度为1 000 nmol/L干预第8天时对3T3-L1 前体脂肪细胞的增殖抑制作用最强。

脂联素是一种由244个氨基酸组成的蛋白质[12]，是一种几乎全部由脂肪细胞分泌的脂肪因子，也是唯一一个分泌量与脂肪细胞体积呈反比的脂肪因子，具有改善外周和肝脏胰岛素抵抗的作用。因此，本研究进一步探讨不同浓度GLP-1作用时间对3T3-L1前脂肪细胞培养基中脂联素含量的影响。结果显示，GLP-1可升高培养基中脂联素的含量，其趋势表现为随着GLP-1浓度的逐渐增高，3T3-L1前脂肪细胞培养液中脂联素含量逐渐升高，呈一定的浓度依赖性且在相同浓度GLP-1干预下，随着作用时间的延长，脂联素的含量也逐渐升高。这些结果初步表明，GLP-1可明显增加3T3-L1前脂肪细胞脂联素的含量，可能是其抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖的机制之一。以往的研究表明脂联素通过与AdipoR1和AdipoR2结合后，分别激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和过氧化酶体增殖物激活受体α(PPARα)途径减少脂肪酸合成，从而减少脂肪的储存而发挥作用[13-14]。因此，GLP-1抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖的分子机制有待于进一步研究。

综上所述， GLP-1可抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖并升高脂联素含量，为临床使用GLP-1干预肥胖症提供了可能，但其作用机制仍有待于进一步深入研究。