贮存条件和灭菌次数对平板计数琼脂培养基的影响

宋 洋

（宁德市食品药品检验检测中心，福建宁德 352100）

食品安全历来备受人们的重视，食品中微生物污染能够影响食品安全[1-2]。人体摄入被微生物污染的食品后，容易引起食源性疾病，危害人们的身心健康。食品微生物检验是运用微生物学的理论和实验方法，对食品中所含微生物的种类、数量、性质及其对人体的健康的影响进行判断，进而判别食品是否符合质量标准的检验方法。开展食品微生物检验可以在一定程度上保障食品安全，食品中微生物菌落总数检验项目是食品微生物检验的常见项目，作为评价食品微生物污染状况的指标之一，可以直观反映食品中微生物数量[3-4]。为了开展食品中微生物菌落总数检验项目，实验室经常会使用到平板计数琼脂培养基（Plate Count Agar，PCA），但在实际工作中，存在平板计数琼脂培养基配制过多，实验后剩余培养基保存后能否再次使用的问题[5]。实验研究不同的贮存条件和灭菌次数对PCA 培养基质量的影响，判断其是否符合《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》（GB 4789.28—2013）要求[6]。

1 材料与方法

1.1 菌株

大肠埃希氏菌 CMCC（B）44102（批号：220218；产品号：33053；规格：500～1 000 CFU/颗），来自北京三药科技开发公司；金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003，（批号：220216；产品号：33025；规格：500～1 000 CFU/颗），来自北京三药科技开发公司；枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501（批号：220812；产品号：33031；规格：500～1 000 CFU/颗），来自北京三药科技开发公司。

1.2 培养基

平板计数琼脂培养基（PCA）（批号：1100441），广东环凯微生物有限公司；胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）（批号：1103601），广东环凯微生物有限公司。

1.3 仪器设备

MLS-3751L-PC 高压蒸汽灭菌器，日本三洋电子科技有限公司；GNP-9270 型隔水氏恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；HFsafe-1200 生物安全柜，上海力申科学仪器有限公司；HYC-940 医用冷藏箱青岛海尔股份有限公司；YP3002 电子天平，余姚金诺天平仪器有限公司；PHS-3C型pH计（E-201-P平面pH 复合电极），上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 培养基的处理方法

（1）培养基配制及灭菌方法。准确称取平板计数琼脂培养基（PCA）、胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），加入对应量的超纯水，煮沸至溶解，121 ℃高压灭菌15 min。

（2）培养基灭菌方法。第1 d 配制两份PCA 培养基并分别编1 号和2 号，灭菌后，取出自然冷却，将1 号放入常温洁净环境存放3 d，将2 号放入洁净冰箱4 ℃存放3 d，第4 d 配制3 号PCA 培养基并灭菌，待3 号自然冷却后，与新配制的4 号PCA 培养基一起放入灭菌，灭菌后自然冷却3 号和4 号，再将3 号、4 号与新配制的5 号PCA 培养基和TSA 培养基一起灭菌，随后将1 号和2 号沸水浴加热融化。上述培养基每份大约配制150 mL。

1.4.2 培养基性能测定

（1）理化特性。①外观性状。平板计数琼脂培养基的色泽、均匀度等变化。②pH 值。培养基灭菌或融化后倒入无菌平皿制成平板，冷却至25 ℃时，测定平板上3 个不同位置的pH 值，取其平均值。③培养基质量。准确称取空瓶质量、灭菌前加入培养基后质量、灭菌后培养基的质量、贮存后培养基的质量。④质量减少率。培养基质量减少率=培养基减少的质量/培养基灭菌前质量，培养基减少质量=灭菌后减少质量+贮存过程减少质量。

（2）生长特性。①菌落总数。用无菌生理盐水溶解稀释菌株至每0.1 mL 含菌数为100～150 CFU，分别吸取菌悬液0.1 mL，均匀涂布接种于待测平板和参比平板。每一稀释度接种两个平板，置于（36±1）℃培养48 h，对菌落总数进行计数。②生长率。生长率测试是GB 4789.28—2013 中培养基和试剂的质量控制的测试方法。按规定用适当方法将适量测试菌株的工作培养物接种至固体、半固体和液体培养基中，每种培养基上菌株的生长率应达到GB 4789.28—2013所规定的最低限值，生长率数值越大说明培养基越适合该种菌株的生长。PCA 培养基作为非选择性分离和计数固体培养基，按GB 4789.28—2013 中非选择性分离和计数固体培养基的目标菌（质控菌株）生长率定量测试方法，PCA 培养基质控菌株生长率（PR）=Ns/No，且应不小于0.7。其中，Ns为待测PCA 培养基平板上质控菌株菌落总数，CFU；No为参比（TSA）培养基平板上质控菌株菌落总数，CFU，该菌落总数应≥100 CFU。PCA 培养基质控菌株生长率定量测试中所用的质控菌株分别为大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。

2 结果与分析

2.1 培养基理化特性测定结果和分析

按照1.4.2（1）方法，每次灭菌后观察培养基外观变化，测定25 ℃时的pH 值并称重，结果见表1。由表1可知，1 号、2 号、5 号PCA 培养基灭菌1 次后常温保存3 d、4 ℃保存3 d、灭菌后现用对培养基灭菌后的质量、pH、外观影响不大；由5 号、4 号、3 号可知，PCA 培养基随着灭菌次数变多，灭菌后培养基的质量变小，pH 值下降，培养基颜色加深，但均一度不变，也未见浑浊。这主要由于高温灭菌导致培养基水分蒸发，质量变少，同时培养基中少部分还原糖类与氨基酸化合物高温下发生美拉德反应[7-8]，生成有色物质，影响培养基颜色，水分减少。此外，高温可让部分培养基成分发生变化，导致pH 下降但变化不大。

表1 PCA 培养基经不同处理后的理化特性结果

2.2 培养基生长特性测定结果与分析

2.2.1 菌落总数

按照1.4.2（2）方法，用不同质控菌株分别进行菌落总数的测定，结果见图1。

图1 不同处理条件下PCA 培养基质控菌株的菌落总数

由图1可知，3 株质控菌株在5 种处理条件下的PCA 培养基平板上的菌落总数存在差异，灭菌1 次后现用且未经过保存3 d 处理条件下的PCA培养基上3 种质控菌株的菌落总数均为最高。由5号、4 号、3 号可知，随着PCA 培养基灭菌次数增加3 种质控菌株的菌落总逐渐减少，灭菌3 次的PCA 培养基上质控菌株的菌落总数最低；由1 号、2 号、5 号可知，相比灭菌1 次现用处理条件下的培养基，PCA 培养基灭菌1 次后常温保存3 d 和4 ℃保存3 d 处理条件下的3 种质控菌株的菌落总数减少。

2.2.2 生长率测定结果与分析

按GB 4789.28—2013 要求，PCA 培养基质控菌株的生长率PR≥0.7。由表2可知，3 种质控菌株分别在经5 种不同处理条件后的PCA 培养基上的生长率都能达到PR≥0.7 的要求。说明这些处理对PCA 培养基质量影响较小，仍满足培养基的质量标准要求。

表2 不同处理条件下PCA 培养基的生长率结果

3 结论

《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》（GB 4789.28—2013）是关于培养基质量要求方面现行有效的国家标准。此标准规定了培养基的质量应符合的基本要求和微生物学要求。其中基本要求包括培养基外观、色泽、均一性和pH 等方面；微生物要求指生长特性，包括生长率、选择性两方面。若培养基的基本要求和微生物学要求均符合规定，则该批培养基可被接受，能够满足实验需要。

实验把食品微生物检验中经常使用的非选择性培养基中的PCA 培养基当作研究对象，改变灭菌后PCA 培养基的贮存条件或灭菌次数，按GB 4789.28—2013 对培养基质量的要求，进行了pH 值、色泽、均一度和质量等理化性质以及质控菌株生长情况和生长率的测定。结果表明，PCA 培养基灭菌后在常温保存3 d、4 ℃保存3 d、灭菌3 次的质量都能符合GB 4789.28—2013 要求，满足实验需求，不会影响培养基的性能，可能是由于PCA 培养基组成成分简单、稳定，灭菌后放置贮存再融化和重复灭菌不易破坏有效成分，且PCA 培养基为非选择性分离和计数固体培养基，极其适合微生物生长，所以微生物对PCA培养基质量要求降低。

上述实验结果应用在实际工作中，可将实验剩余PCA 培养基放置于洁净或无菌环境保存，短期内可灭菌或直接融化后再次使用，便于节省PCA培养基。同时，若实验室预先配制并贮存PCA 培养基也能够帮助解决因灭菌设备不足无法短期内完成大批量检验任务的问题，进一步提高实验便利性。但从实验结果也可以看出，灭菌1 次现用的PCA 培养基最适合微生物生长，所以日常开展实验中仍尽可能采用这种方式处理培养基。但是，不是所有培养基经过上述条件处理后都仍能满足实验需要。不同培养基的组成成分不同，有些培养基组成成分复杂、不稳定，不能重复灭菌，或者有些培养基的组成成分在贮存过程中容易自行降解，甚至不同厂家不同批次的同一培养基也存在成分或质量差异，所以需要根据具体培养基的类别和性质开展实验验证后，才能确定贮存条件或灭菌次数对该培养基质量的影响。此外，贮存培养基的环境应尽量保持洁净或无菌，贮存过程也应进行信息登记，才能保证培养基的质量。