抗应激添加剂对运输后肉牛应激蛋白mRNA和蛋白表达水平的影响

曹中赞，王晓娜，李 静，陈美月 ，许建文 ，栾新红

（1.沈阳农业大学 畜牧兽医学院，沈阳 110161；2.辽宁省畜牧业经济管理站，沈阳 110032）

在现代肉牛的集约化养殖过程中，引种、售卖、异地屠宰和繁育等需要肉牛的流转运输。而由于冷、热、风、雨、颠簸、拥挤、噪音、惊吓、饥渴、体力耗费、环境变化及潜在疾病等应激因素的影响，肉牛会在运输过程中出现较为常见的应激症状，表现为失重、致残或致死、肉品质和免疫力降低等，可见，运输应激对肉牛生产会造成重大经济损失。研究认为，机体在遭受应激源刺激时，比如缺血[1]、缺氧[2]、中毒[3]、能量损失[4]，以及红外线辐射[5]、磁场[6]，甚至心理方面的影响[7]等，都会发生应激反应，并可能诱导产生一些具有不同生理功能的应激蛋白（stress protein），其中研究最多的是热应激蛋白（heat shock protein，HSP）[8]。热应激蛋白对细胞的生存能力和维持内环境的稳定具有重要意义[9-11]。之前很多研究人员通过给予猪只不同刺激来探究HSPs的表达及其变化，但在不同肌肉组织中并未发现HSPs表达的变化[12-15]，有关动物运输后肌肉组织HSPs表达的研究报道更少[12-13,16]。本研究以辽育白牛为研究对象，饲喂两种抗应激添加剂后进行运输，探讨运输过程对肉牛机体应激蛋白表达的影响，以及两种抗应激添加剂对肉牛运输应激是否有改善作用，以期为两种抗应激添加剂在肉牛生产中的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物及分组 选择体重和体况相近的健康出栏育肥辽育白牛27头，随机分成3组：对照组、抗应激1号组和抗应激2号组，每组9个重复，每个重复1头牛，其中对照组饲喂常规基础饲粮，抗应激1号组饲喂添加剂1号，抗应激2号组饲喂添加剂2号，每天1次，饲喂10d，在20℃、相对湿度51%的环境条件下，以50～60km·h-1的速度在公路上运输5h，其他内容同王晓娜等[17]的报道。

1.1.2 主要试剂及器械 HSP70酶联免疫吸附测定试剂盒 （南京建成生物工程研究所）、HSP90抗体和HSP70抗体（北京博奥森生物技术有限公司）及辣根过氧化酶标记山羊抗兔二抗（巴基斯坦SANTA公司）、Prime Script RT Reagent Kit试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白提取试剂盒、丽春红染色液及ECL化学发光染料（北京普利莱公司）等。酶标仪（TECAN公司）、凝胶成像系统（以色列DNR Micro Chemi 4.2）、PCR扩增仪（S1000）和实时荧光定量PCR仪（iQ5）（美国Bio-Rad公司）等。

1.1.3 样品采集 分别于运输前和运输后采集肉牛血液，制备血清，置于-20℃冰箱待测。运输后进行屠宰，采集肉牛肌肉组织，液氮冻存备用。

1.2 方法

1.2.1 肉牛血清中HSP70含量的检测 采用ELISA法检测肉牛血清中HSP70的含量，具体操作根据HSP70酶联免疫吸附测定试剂盒说明书。

1.2.2 肉牛运输后肌肉组织内HSP27、HSP70和HSP90 mRNA表达量的检测

1.2.2.1 组织样本总RNA的提取与反转录 从每组肉牛肌肉组织样品中分别随机选出3个，利用Trizol法进行总RNA的提取，然后进行反转录，具体操作方法参见Prime Script RT Reagent Kit试剂盒说明书，所得反转录产物cDNA用于后续反应。

1.2.2.2 引物设计与合成 根据GenBank中已有的牛的看家基因GAPDH（Genbank:XR_083674.4）及目的基因HSP27（Genbank:BT021550.1）、HSP70（Genbank:BT030673.1）和 HSP90（Genbank:NM_001012670.2）的序列信息，采用Primer6.0设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成，引物序列见表1。

1.2.2.3 实时荧光定量PCR 按20μL反应体系进行qRT-PCR反应 （具体操作参照试剂盒说明书）：SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，上、下游引物各 0.8μL，cDNA 2μL，ddH2O 6.4μL。 一个组织样品设定 3 个平行，并同时设置阴性对照（在阴性对照孔内加入2μL ddH2O），利用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，其公式为：

表1 肉牛内参基因及目的基因的引物序列Table 1 Primer sequence of reference gene and target gene in beef cattle

1.2.3 肉牛运输后肌肉组织内HSP70和HSP90蛋白表达水平的检测

1.2.3.1 组织样本总蛋白的提取 按照试剂盒说明书提取运输后肉牛肌肉组织的总蛋白，并使用BCA试剂盒检测总蛋白量。

1.2.3.2 HSP70和HSP90蛋白表达量的检测及数据分析 分别配制分离胶（浓度10%，pH值8.8）和浓缩胶（浓度5%，pH值6.8），然后分别灌入分离胶和浓缩胶，蛋白样品与5×SDS上样缓冲液（5×loading buffer）按4∶1混匀，加入5μL彩色预染蛋白Marker后上样，按上层胶电压为80V，30min电泳；下层胶电压为120V，直至溴酚兰距离底端0.5cm时，电泳终止，进行转膜。设置恒流300mA，恒压15V，80min。转膜结束后，封闭过夜。用稀释后的一抗（HSP70和HSP90抗体1∶500；GAPDH内参抗体1:1000）孵育PVDF膜，4℃过夜或室温水平摇床孵育1～2h 后，洗膜 4 次，每次 7min。 用 TBST（1∶3000～1∶5000）稀释二抗，并孵育 2h，然后连续洗膜 5 次，每次 7min。将配制好的ECL化学试剂A液与B液滴到PVDF膜上，反应3min后，应用超灵敏化学发光成像系统Gelcapture Chemi进行成像。用GelQuant分析软件对目的蛋白灰度值进行半定量分析，取目的蛋白与内参蛋白灰度值之比（或灰度比值）。

1.3 数据统计分析

对数据进行整理和统计分析，用 “平均值±标准差”表示，利用SPSS17.0软件中One-Way ANONA法的Tukey HSD和LSD进行统计分析，差异显著用p＜0.05表示，差异极显著用p＜0.01表示。

2 结果与分析

2.1 运输前后肉牛血清HSP70含量的检测结果与分析

运输前后肉牛血清HSP70含量的检测结果见表2。由表2可知，抗应激1号组运输后和运输前同对照组相比，血清中HSP70浓度均极显著减少（p＜0.01），抗应激2号组运输前较抗应激1号组极显著增加（p＜0.01）。相对于运输前，各组运输后血清HSP70含量均有升高趋势，其中抗应激1号组运输后的增加幅度极显著高于抗应激2号组(p＜0.01)，但与对照组相比差异不显著(p＞0.05)。由此可见，运输使肉牛血清HSP70含量升高，而饲喂抗应激添加剂1号可以明显增加运输后肉牛血清的HSP含量。

2.2 运输后肉牛肌肉组织中HSP27、HSP70和HSP90 mRNA的表达量

运输后各组肉牛肌肉组织内HSP27、HSP70和HSP90 mRNA表达水平的检测结果见表3。由表3可知，运输后，抗应激添加剂组肉牛肌肉中HSP27 mRNA表达量均比对照组低，且抗应激1号组较对照组和抗应激2号组均显著降低（p＜0.05），抗应激2号组与对照组差异不明显（p＞0.05）。两个抗应激添加剂组HSP70 mRNA表达量比对照组显著降低 （p＜0.05），抗应激1号组同抗应激2号组之间差异不大 （p＞0.05）。抗应激添加剂组HSP90 mRNA的表达量均较对照组明显降低（抗应激1号组：p＜0.05；抗应激2号组：p＞0.05），两个抗应激添加剂组之间差异不显著（p＞0.05）。

2.3 运输后各组肉牛肌肉组织中HSP70和HSP90蛋白的表达量

运输后肉牛肌肉组织中HSP70和HSP90蛋白表达量的检测结果见图1和表4。

表2 运输前后肉牛血清HSP70含量的检测结果Table 2 Serum HSP70 content of beef cattle before and after transportation /ng·L-1

表3 运输后肉牛肌肉组织中HSP27、HSP70和HSP90 mRNA的表达量Table 3 The mRNA expression of HSP27,HSP70 and HSP90 in beef muscle tissue after transportation

由图1和表4可知，运输后，抗应激添加剂组肉牛HSP70蛋白的表达量较对照组明显减少（p＜0.01），两个抗应激添加剂组之间表达量差异不明显（p＞0.05），但抗应激添加剂2号组较抗应激添加剂1号组略高；抗应激添加剂组HSP90蛋白的表达量均较对照组明显减少（p＜0.05），抗应激添加剂2号组表达量较抗应激1号组略高，但差异不显著（p＞0.05）。

图1 HSP70和HSP90蛋白相对表达量的检测结果Figure 1 Relative expression of HSP70 and HSP90

表4 运输后肉牛肌肉组织中HSP70和HSP90蛋白表达水平的检测结果Table 4 Relative expression levels of HSP70 and HSP90 protein in muscle tissues of beef cattle after transportation

3 讨论与结论

1962年，RITOSSA[18]在试验中发现，过热的环境中果蝇唾液腺染色体会出现疏松部形态上的变化。到了1974年，TISSIERES等[19]才证实这种变化是因为过热环境激发了染色体内的基因转录，合成了一组具有特殊功能的蛋白质，即HSPs，伴随其合成，其余蛋白质的合成将会受到相应抑制。HSPs广泛存在于生物界，保守性很高，当细胞受到一系列不利刺激时（例如高温、缺氧、缺血、感染等），它会迅速的大量合成，并和细胞内一部分变性了的蛋白质发生结合，从而发挥保护作用。当机体发生应激时，HSPs的出现标志着细胞启动自我保护。有研究证明，HSP70结构高度保守，具有很多生物学功能，除了对遭受应激的动物机体具有一定的保护作用外，还可以作为佐剂[20-21]，是机体发生应激反应时生成量最多的应激蛋白家族成员之一[22-23]，能够帮助新合成的多肽键的延展和折叠，并可纠正多肽链的错误折叠等。当机体遭受应激源刺激时，体内的应激蛋白会急剧升高，其含量会发生急剧变化，继而稳定改变的细胞内环境，维持细胞的生存[24-25]。HSP的生物学作用非常多，涉及的方面也越来越广，很多学者认为HSP可以作为应激指征[26]。周京军等[27]曾发现，受应激刺激的心肌细胞因HSP70表达量增加而受到保护，心肌细胞恢复其功能的时间会大大缩短，心肌梗死面积也会显著缩小。本试验发现，运输可导致肉牛血清HSP70含量和肌肉HSP70表达量明显增加，这可能与机体对抗运输应激带来的危害有关。

有资料显示，HSP90和HSP70两种应激蛋白可以与其他分子一起行使调节功能，尤其在心肌细胞内，如果HSP90含量升高则可降低或者减少发生心梗的程度和范围[28-29]，而HSP90在心脏中含量的减少会增加发生心脏病的风险，导致死亡率升高。本试验中，运输后肉牛肌肉组织中3种应激蛋白HSP27、HSP70和HSP90在mRNA水平的表达量，以及HSP70和HSP90在蛋白水平的表达量均明显增加，尤其是HSP70的蛋白表达量极显著升高。由此推测，运输可能通过诱发应激反应而明显增加肉牛肌肉组织中3种应激蛋白HSP27、HSP70和HSP90的含量。而饲喂抗应激添加剂的两组几种应激蛋白的含量均较对照组低，虽然运输后应激蛋白的增加可以缓解运输导致的应激反应所带来的机体损害，但机体短期迅速地合成应激蛋白可能会过度消耗体内的能源物质，饲喂抗应激添加剂有望避免应激反应后应激蛋白急剧大量合成所造成的过度消耗，而抗应激1号组运输前和运输后血清HSP明显均较其他组低，但其运输后较运输前增加幅度要高于其他两组，尤其是显著高于抗应激2号组，显然抗应激1号添加剂抵抗应激、减少机体消耗的效果较2号添加剂更明显。本试验结果显示，屠宰前的运输会导致肉牛血液和肌肉中应激蛋白含量增加，从一定程度上可以缓解运输应激对机体造成的损害，但运输过程中的惊恐和高度紧张状态使畜体自身营养消耗加快，运输应激使机体快速合成大量应激蛋白，从而导致体内营养物质的过度消耗。研究中运输前饲喂抗应激添加则可以有效缓解了这种状况，这将有利于机体稳态的维持，提高机体抗应激能力。所以，养牛生产中可以考虑在运输前饲喂抗应激添加剂，以提高畜体抗应激、保持机体稳态的能力，有利于生产效益的提高。

综上所述，运输使肉牛血清和肌肉组织中应激蛋白含量增加，而抗应激添加剂可影响运输后肉牛血清及肌肉组织中应激蛋白的水平，尤以抗应激1号作用更明显。