电针夹脊穴和足阳明胃经穴对脊髓损伤大鼠下肢神经功能恢复和突触素I的影响比较

吴俏锋，周宾宾，魏卫兵，覃镜羽，冯振奋，李建男

1.广西中医药大学，广西南宁市 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西南宁市 530023

脊髓损伤具有致残率高、康复难和病程长的特点，治疗和康复产生的高费用为患者家庭带来严重负担。如何促进脊髓损伤后神经功能恢复及突触再生为近年来的研究热点[1]。

中医在脊髓损伤的康复和治疗中有着独到的优势，其中针灸基于深厚的经络理论，在促进神经功能恢复及缓解并发症上有着可观的效果[2-4]。由于脊髓的解剖位置和功能与中医督脉高度相似，现代中医临床有“脊柱损伤即督脉损伤”之说[5]。脊髓损伤后其损伤平面以下运动神经功能障碍的症状，可归于传统医学中“痿症”的范畴。基于《内经》“治痿独取阳明”的理论，临床对于脊髓损伤的针灸研究多为阳明经穴干预实践，但缺乏相关实验研究。

Synapsin I 作为只存在于突触前囊泡膜上的特异性蛋白，对囊泡运输、神经递质的释放和突触的可塑性具有重要的意义[6-7]，其分布和表达可反映神经元突触的功能[8-9]。

本研究拟建立缺血损伤型大鼠脊髓损伤模型，通过BBB评分评价不同时间点大鼠脊髓损伤后神经功能情况，比较电针夹脊穴和足阳明胃经对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响，并检测不同时间点脊髓损伤部位Synapsin I 的mRNA 和蛋白水平，以验证“治痿独取阳明”。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年雌性SPF 级Sprague-Dawley 大鼠60 只，体质量180～220 g，由广西医科大学动物实验中心提供，动物生产许可证号SCXKX-2014-0002。实验过程中严格遵守动物福利与伦理准则和指南的相关规定。

1.2 主要仪器和试剂

SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5×)：碧云天，货号P0015L。PMSF：碧云天，货号ST506。RIPE 蛋白裂解液：索莱宝，货号R0020。Trizol：大连宝生物，货号9109。SYBR Green mix：南京诺维赞，货号Q111-01。反转录试剂盒：FERMENTAS 公司，货号K1622。Synapsin I一抗：博士德生物，货号BA1421，75 kDa。Tanon-4200 全自动化学发光图像分析系统。电泳仪：北京六一。半干转膜仪：日本ATTO。ABI7500荧光定量PCR仪。

1.3 造模

根据课题组前期研究的结果[10-12]，采用缺血损伤型造模方法，对实验大鼠T10椎板切除后采用血管钳钳夹脊髓的方法进行造模。10%水合氯醛3.5 ml/kg 腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后术区备皮，俯卧位固定于手术台上，术区碘伏常规消毒。以T10棘突为中心切开皮肤约3 cm，分离皮下筋膜及椎旁肌肉，暴露T9～T11棘突及椎板，修剪棘间韧带，用眼科镊夹持T10棘突轻轻上提，扩大T10～T11椎体间隙后，以12 cm 持针器经扩大的椎体间隙与脊髓平行咬除椎板，暴露硬脊膜。用血管夹(夹力约60 g)穿过脊髓椎体之间，钳夹脊髓30 s 导致T10脊髓缺血损伤。轻柔打开抽出血管夹，温盐水冲洗伤口，逐层缝合肌肉、筋膜及皮肤。术后前3 d 每天皮下注射20 万U 青霉素钠预防感染，每日定期膀胱压迫排尿2次。

造模成功标准：①闭合血管夹后脊髓表面迅速渗出暗红色血液，同时可见下肢抽搐及尾巴左右摆动；②术后第1 天可见大鼠双下肢功能完全丧失，肌力0级，双下肢拖行移动，BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)评分[13]均为0。

1.4 分组

造模成功后，将每只大鼠编号，根据Excel 生成的随机号码分为对照组、夹脊穴电针组(夹脊组)和足阳明胃经电针组(阳明组)，每组20 只，均于造模成功3 d 后开始干预。分别于干预后第1 周、2 周、3 周、4周和5 周结束时取材，每个时间点4 只大鼠。自干预起，每天按BBB评分标准对大鼠进行行为功能评估并记录。

1.5 干预

参照全国针灸协会实验针灸研究会制定的《实验动物针灸穴位图谱》，选穴方法：①对照组造模后不做干预；②夹脊组选取后背T9和T11椎体棘突平面夹脊穴；③阳明组选择双侧伏兔、足三里穴。

以上每个穴位各刺入一根毫针，穿皮后再进针约2 mm，刺激强度12～15 mV(C6805-I 型电针治疗仪)，刺激频率2 Hz，疏密波，留针30 min。工作日每天1次，连续5周。

1.6 灌注、固定和样本采集

每组大鼠于相应干预时间，以10%水合氯醛0.35 ml/100 g 腹腔注射，麻醉后固定于手术台上，用手术剪剪开胸腔暴露心脏，于心间处穿入灌胃针至升主动脉，并用止血钳将灌胃针与心尖固定，剪开右心耳后，0.9%氯化钠溶液灌注至大鼠眼睛、肝脏等颜色变淡，且右心耳流出液体清彻。

每个亚组取1 只大鼠4%多聚甲醛溶液继续灌注，待大鼠四肢、尾部和躯干僵硬后停止。处死后用手术剪分离出损伤部分脊柱，小心取出以损伤点为中心长约1 cm 的脊髓组织，浸入4%多聚甲醛溶液中固定，行病理切片用于HE 染色和免疫组化染色。每个亚组剩余3 只大鼠取损伤脊髓标本保存于液氮中，用于行Western blotting 和逆转录实时定量聚合酶链反应(reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)。

1.7 检测

取1 份标本石蜡包埋后，切成5 μm 的石蜡切片，50 ℃温水中展片、贴片后，放于60 ℃恒温箱内烤片2 h备用。

1.7.1 HE染色

取上述标本经过苏木素染色5 min；盐酸乙醇分化5 s；自来水返蓝15 min；伊红染色5 min；95%乙醇快速清洗2 min，共2次；无水乙醇快速脱水；二甲苯透明5 min，共3次；树胶封片；镜检拍照。

1.7.2 免疫组化染色

取上述标本经过柠檬酸钠高压抗压修复，3%H2O2溶液室温孵育以消除内源性过氧化物酶的活性，滴加Synapsin I 多克隆抗体工作液，Synapsin I 抗体稀释液(稀释浓度1∶85)50 μl，置于湿盒中孵育2 h；室温下滴加二抗，DAB 显色，显微镜下观察，阳性显色为棕黄色、棕色或棕褐色；经复染、脱色、反蓝、脱水、透明、封片后，于显微镜下观察。

Synapsin I 染色以细胞质中出现明显黄色或棕黄色颗粒视为阳性着色，染色结果根据免疫组化半定量评分标准[14]。高倍镜(×400)下对每张切片任意选5 个视野，计数200个细胞/视野，共计1000个细胞，观察其阳性细胞表达强度。A 为阳性细胞数分级，0%～1%=0，1%～10%=1，10%～50%=2，50%～80%=3，80%～100%=4；B 为阳性细胞显色强度分级，阴性=0，弱阳性=1，阳性=2，强阳性=3。免疫组化评分(immunohistochemical scores,IHS)=A×B[14]。

1.7.3 RT-qPCR

取上述液氮保存组织(每份标本50～100 mg)，用Trizol 提取总RNA，紫外分析测定所抽提RNA 的浓度。使用反转录试剂盒将1 μg RNA 反转录成cDNA。使用荧光定量PCR 仪进行cDNA 扩增与检测，反应条件：95 ℃120 s，循环40 次，95 ℃15，60 ℃20 s，72 ℃20 s。

设计合成Synapsin I 引物序列：上游引物5′-GAT GGT TCG ACT ACA CAA-3′，下游引物3′-TCT TCA CAA CTA CAG GGT-5′(扩增片段长度116 bp)。

ATCB 内参序列：上游引物5′-GCT ATG TTG CCC TAG ACT TCG A-3′，下 游 引 物3′-GAT GCC ACA GGA TTC CAT A-CC-5′(扩增片段长度173 bp)。

反应体系：2×SYBR Green Mix 10μl，上、下游引物各1 μl，cDNA 5 μl，超纯水4 μl，采用△△Ct 法进行基因表达的相对定量。

1.7.4 Western blotting

取上述液氮保存的标本，用RIPE 裂解液提取蛋白后进行SDS-PAGE 电泳，上样后经电泳、转膜、封闭后加1∶400 Synapsin I 蛋白稀释抗体4 ℃孵育过夜，次日用含5% 脱脂奶粉的TBST 溶液稀释二抗(1∶3000)，室温孵育后，曝光并拍照记录。用软件分析图像，以β-actin 蛋白作为内参，以Synapsin I 蛋白与内参的比值作为相对表达量。

1.8 统计学分析

采用SPSS 17.0 进行统计分析。计量结果以(xˉ±s)表示。多样本间比较用单因素方差分析，方差齐性时，采用LSD检验；方差不齐时，采用Dunnett's T3检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 BBB评分

夹脊组和阳明组术后1～5 周BBB 评分均高于对照组(P<0.05)。阳明组1～3 周BBB 评分高于夹脊组(P<0.05)，4～5 周两组间比较无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.2 HE染色

对照组1～2周时脊髓结构极度紊乱，神经元消失，部分髓鞘脱失，中度炎细胞浸润；随着时间延长逐渐好转；5 周时脊髓结构轻微紊乱，神经元数量明显增多，无髓鞘脱失，偶有炎细胞浸润，无明显出血。阳明组1 周时脊髓灰质区中度炎细胞浸润，毛细血管数量增多，结构稍紊乱；后逐渐好转，5 周时可见炎性细胞浸润明显减轻，神经元数量明显增多。夹脊组1周时脊髓灰质区中度炎细胞浸润，毛细血管数量增多，有轻微出血，有少量脂肪滴脊髓结构稍紊乱；后逐渐好转，5 周时可见轻度炎细胞浸润，神经元数量增多。见图1。

2.3 免疫组化染色

Synapsin I 蛋白阳性表达位于细胞膜和细胞浆内，第1 周起，蛋白阳性表达逐渐增强；第3 周时，阳性表达最高；从4周开始，阳性表达逐渐降低。见图2。

夹脊组1 周时Synapsin I 蛋白IHS 高于对照组(P<0.05)，阳明组1～4 周均高于对照组(P<0.05)。阳明组3～4周时SynapsinI蛋白IHS高于夹脊组(P<0.05)。见表2。

2.4 RT-qPCR

对照组Synapsin I mRNA 表达随着时间的延长呈现先升高后降低的趋势，4周时达到高峰，5周开始降低。夹脊组1 周时Synapsin I mRNA 表达高于对照组(P<0.05)，阳明组1～4 周均高于对照组(P<0.05)。阳明组3 周时Synapsin I mRNA 表达高于夹脊组(P<0.05)。见表3。

表1 各组不同时间点BBB评分比较

表2 各组Synapsin I蛋白IHS比较

图1 各组脊髓形态(HE染色，×400)

图2 各组Synapsin I蛋白表达(免疫组化染色，×400)

表3 各组Synapsin I mRNA表达(△△Ct)

2.5 Western blotting

对照组Synapsin I 蛋白随着时间的延长呈现先升高后降低的趋势，在3 周时达到高峰，3 周后逐渐降低。夹脊组1周时Synapsin I蛋白表达高于对照组，阳明组1～4 周时均高于对照组(P<0.05)。阳明组Synapsin I蛋白表达2～3周高于夹脊组。见图3、表4。

3 讨论

脊髓损伤后早期手术能有效缓解继发性损伤[15]，中后期则是漫长的康复治疗。针灸作为中医特色疗法之一，具有促进神经功能康复、缓解并发症等独特的优势[16]。临床上治疗脊髓损伤选穴主要以督脉和足阳明胃经为主，然而对于脊髓损伤电针干预的动物实验研究多为督脉或夹脊穴。

图3 各组脊髓损伤部位Synapsin I蛋白条带图(Western blotting)

表4 各组Synapsin I蛋白表达(/β-actin)

邹恩苗等[17]对48 只Sprague-Dawley 大鼠电针督脉和夹脊穴后观察7 d，发现白细胞介素(interleukin,IL)-lβ、IL-6 下调，IL-10 上调。李晓宁等[18]发现电针夹脊穴能够改善脊髓损伤大鼠运动功能，可能与抑制NLRP3 炎症小体过度活化、降低caspase-1 表达有关。还有研究发现[19]，电针夹脊穴可抑制损伤局部Ras 同源基因Rho 相关螺旋卷曲蛋白激酶(Ras homologous gene/a Rho-associated coiled coil-forming protein kinase,Rho-ROCK)Ⅱ信号通路RhoA、ROCKⅡ、肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)的表达。刘鹏民等[20]观察到督脉电针具有上调生长相关蛋白(growth associated protein,GAP)-43、抑制Nogo-A 的作用。Tu等[3]发现督脉电针可以上调损伤局部脊髓脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和神经营养因子(neurotrophin-3,NT-3)的水平，且跨损伤部位的大椎、命门穴电针效果较损伤截面以上的百会、风府穴要好。Mo 等[21]更是观察到神经元数量增多的现象。

可见基于“督脉论治脊髓”理论，电针督脉或夹脊穴对脊髓损伤大鼠下肢神经功能恢复具有促进的作用，同时还兼具减轻炎症反应、抑制神经细胞凋亡、促进突触再生、缓解脊髓损伤并发症等众多效果。

然而中医素有“同病异治”的观点，脊髓损伤表现为下肢运动功能障碍，可归属于中医“痿症”的范畴，《内经》有“治痿独取阳明”的理论诠释，但是缺乏实验研究证明。《素问·痿论》中“阳明者，五脏六腑之海……而阳明为之长，皆属于带脉，而络于督脉，故阳明虚则宗筋骨纵，带脉不引，故足不用也”也阐述了足阳明胃经与督脉和痿症的关系。基于此理论，夏士涛等[22]电针足阳明胃经治疗脊髓损伤也取得较好的效果。

本实验观察对比电针夹脊穴和足阳明胃经穴对脊髓损伤后大鼠神经功能的影响。选择足三里作为足阳明胃经合穴，具有远治调理脾胃，补益气血的功效，符合“治痿独取阳明”的理论要求，伏兔同属足阳明胃经，为临床治疗下肢瘫痪的常用穴，故选为配穴。《华佗别传》“又有人病脚躄不能行，……后灸愈。灸处夹脊一寸上下行，端直均调如引绳也”指出夹脊穴对于下肢功能障碍的治疗作用，选取损伤部位附近夹脊穴作为本实验研究对象主要取其近治行气活血的功效[17-18]。

Synapsin I 最早被发现于1985 年，是一种与神经生长、修复再生和突触重塑密切相关的Ca2+敏感蛋白[23]，广泛存在于突触前膜中，其水平被认为是神经递质释放、神经元之间突触强度的重要指标而应用于神经功能研究中[9]。其对突触小泡的作用在于去磷酸化的状态下与突触小泡结合，磷酸化后从囊泡中解离，最终允许神经递质的胞吐作用[24]。而神经递质作为突触间传递的主要介质，Synapsin I 蛋白可反映突触胞吐的能力[25-26]。另有研究表明[27-28]，Synapsin I 在分布和数量上与突触的数量和密度具有相关性，可作为观察突触密度和分布的指标。此外，Synapsin I 对于突触的形态结构也尤为重要[29]。神经再生主要与突触的重塑有关，因此，Synapsin I 的表达量和密度分布等可作为反映神经功能的特异标志物。

本研究中，脊髓损伤后所有大鼠均出现典型的双后肢瘫痪，术后10 d 大鼠的后肢运动功能逐渐开始有不同程度的改善，电针干预对后肢运动功能恢复作用明显，BBB 评分要优于对照组。对照组BBB 评分在经过一段低水平分值后开始逐渐上升，夹脊组1 周即出现神经功能改善，阳明组改善更佳。RT-qPCR 结果显示，术后Synapsin I mRNA表达先上升后下降，4周时达到高峰。夹脊组Synapsin I mRNA 表达总体高于对照组，但是只有1 周时有显著性差异，阳明组1～4周均优于对照组。Western blotting 结果显示，对照组Synapsin I蛋白改变峰值相对mRNA 提前，3周时就已达到高峰，改变趋势接近BBB评分，可能与脊髓损伤后早期局部炎症、缺血条件未能得到改善，神经元代谢和蛋白降解功能受影响有关[30]。HE 染色也可见3周后炎性细胞浸润改善；夹脊组Synapsin I 蛋白水平提高，但是只有1 周时有显著性差异，阳明组1～4 周均优于对照组。另有研究表明，大鼠脊髓损伤后辅助运动或自由运动均对脊髓损伤康复具有促进作用[31-32]，本研究中阳明组电针时也可见大鼠双下肢肌肉收缩，可能由于此原因，Synapsin I蛋白量5周时组间无显著性差异。

综上所述，本研究结果提示，经过缺血损伤型造模后，脊髓损伤大鼠下肢神经功能具有可逆自行恢复的现象。电针夹脊穴和足阳明胃经可以促进脊髓损伤大鼠下肢神经功能的恢复，体现电针的促进修复效能和“治痿独取阳明”的微弱优势，同时也显现了中医“同病异治”的临床特点。

本文作为电针足阳明胃经对脊髓损伤后神经康复的初步探索，为临床治疗脊髓损伤选穴提供实验证据。但由于实验样本数不多或存其他调控及偏倚原因，部分数据未能体现出统计学差异，HE 染色提示的炎症缓解和神经细胞增多也未能定量比较，有待今后进一步研究。电针夹脊穴或督脉治疗脊髓损伤已具有多靶点的认识[33]，“治痿独取阳明”能否拥有更优的效果，亦有待进一步探讨。