基于肠道菌群结构特征研究胰腺癌不同中医证型与预后的相关性

陈 卓 钱 祥 张爱琴 傅晓璇 甄宏德

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）生长迅速，侵袭性强，恶性程度高，具有临床表现隐匿、预后极差的特点[1]。胰腺癌确诊时已为晚期的患者术后1 年生存率为30%～40%，2 年生存率不足20%，5 年生存率仅为5%左右[2]。近年来，中医在恶性肿瘤治疗中的优势逐渐显现，已成为胰腺癌的重要治疗手段[3]。

“辨证论治”是中医治疗胰腺癌的理论核心。随着基因组学、代谢组学、肠道微生态方面研究的发展，为胰腺癌证候的研究提供新的技术平台。本文旨在利用现代生物手段分析胰腺癌不同中医证型肠道菌群结构特征及总生存期差异，探究两者间的内在联系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 抽取2018 年1 月1 日—2018 年9月30 日在浙江省肿瘤医院腹部肿瘤放疗科及腹部肿瘤内科收治的符合纳入标准的胰腺癌患者36 例，根据中医证型分为气血瘀滞组12 例、脾虚湿热组11例及湿热内蕴组13 例。另设浙江中医药大学研究生正常健康人群8 名作为健康对照组。本临床研究经浙江省肿瘤医院伦理委员会审核通过，伦理批件号为IRB-2018-194。

1.2 纳入标准（1）胰腺癌患者入组标准：年龄18～70 岁；经组织病理学和（或）细胞学证实为胰腺癌[4]的患者；非其他部位肿瘤转移至胰腺部；符合中医辨证分型[5]为湿热内蕴证、气血瘀滞证及脾虚湿热证之一的患者；签署知情同意书。（2）正常健康人群入组标准：年龄18～70 岁；无消化道、心脑血管或其他主要脏器系统的病史；近1 个月内无胃肠病史，无腹泻、无应用抗生素等药物及服用肠道微生态调节剂；无吸烟、饮酒等嗜好；舌质淡红苔薄白，脉象正常。

1.3 排除标准（1）合并心、脑、肝、肾或造血系统等重大内科疾病患者；（2）患有精神疾病患者。

1.4 退出标准（1）患者依从性差，自行要求终止试验；（2）中医证型改变。

1.5 中医辨证分型 中医辨证分型参照相关文献[5]分为三型：气血瘀滞证、脾虚湿热证及湿热内蕴证。（1）气血瘀滞证：左上腹部疼痛明显，痛有定处，呈刺痛或胀痛，腹痛可随情绪变化而有所增减，或夜间痛甚，痞块疼痛拒按，舌紫暗或有瘀斑、瘀点，苔薄，脉弦或细涩；（2）脾虚湿热证：消瘦，神疲乏力，胃纳不佳，腹胀，食后尤甚，便溏甚或如水样，身体困重，身热不扬，舌淡胖，苔黄滑，脉濡而无力；（3）湿热内蕴证：脘腹胀闷，恶心纳呆，口黏不爽，渴不多饮，小便短黄，大便干结或黏滞，或见面目发黄色鲜明，或有身热不扬，汗出热不解，舌质红，苔黄腻，脉滑数。中医证型由三名副主任及以上中医师确认。

1.6 仪器及试剂 KAPA HiFiHotstartReadyMix PCR kit 高保真酶（Kapa Biosystems，KK2602），离心机（XiangYi H1650-W），Light Cycler 96 PCR 仪（Roche，Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler（Life Technologies），电泳仪（Tanon，DYY-6C）凝胶成像仪（Tanon），NanoDrop 2000 Spectrophotometer（Thermo Scientifc)，Qubit2.0 Fluorometer（Invitrogen），2100 Bioanalyzer（Agilent），Miseq Reagent Kit PE300 v3 试剂盒（Illumina，MS-102-3003），QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 试剂盒（Qiagen，51604），AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒（Axygen，ASJ0013），Illumina HiSeq2500 PE250 高通量测序仪（Illumina，Inc，CA，USA），含Qiime 分析软件（Qiime1.9.1）的计算机（Dell）等。

1.7 检测方法 采集受试者粪便，经处理后，进行基因组DNA 提取和质检，进行PCR 扩增和产物纯化，用Illumina HiSeq PE250 平台进行16S rDNA 测序。

Usearch 聚类时，根据丰度从大到小先将序列进行排序，然后通过97%的相似度聚类，得到OTU。将OTU 与RDP 数据库比对，对每个OTU 进行物种分类，得到物种丰度表，进行后续分析。根据每个样本文库中的OTU 丰度信息，使用Shannon Index 和稀疏性曲线来评估文库的多样性，使用Qiime 软件来计算Shannon Index，使用aRarefactWin 软件来计算稀疏性曲线。各样品间微生物群落结构的差异采用Unweighted Unifrac PCoA 法分析。

1.8 随 访 随访患者，统计其总生存时间，生存起始时间为首次经穿刺活检或手术病理证实为胰腺癌的时间，终点时间为患者死亡，随访结束即截尾时间为2019 年2 月1 日。

1.9 统计学方法 用SPSS 16.0 软件进行数据分析。满足正态分布，方差齐性的定量资料用独立样本t 检验。不满足正态分布的资料用非参数检验。使用秩和检验方法对不同分组之间进行显著性差异分析，找出对组间划分产生显著性差异影响的物种，采用R 语言stats 包的kruskal.test 函数找出不同组间有明显差异的物种。用Log rank 法比较不同组间总生存时间的差异。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌不同中医证型患者一般资料比较 收集胰腺癌患者36 例，排除或退出共8 例，最终纳入28例，其中气血瘀滞组9 例，脾虚湿热组9 例，湿热内蕴组10 例。胰腺癌不同中医证型患者在性别、年龄、分期等一般资料上差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 胰腺癌不同中医证型患者一般资料比较

2.2 OTU 韦恩图分析 本研究中36 个样品（气血瘀滞组、脾虚湿热组、湿热内蕴组及健康对照组各含样品9、9、10、8 个）共产生796 个OTU。四组之间相似的OTU 占30%，四组共有的OTU 为241 个。不同组间也确实存在一些OTU 是其他组所没有的，初步说明胰腺癌不同中医证型患者及健康对照组四组之间OTU 具有一定的差异。

图1 OTU 韦恩图

2.3 物种组成分析 气血瘀滞组丰度最高的前5 个属依次是拟杆菌属（Bacteroides），普氏菌属（Prevotella），普拉梭菌属（Faecalibacterium），双歧杆菌属（Bifidobacterium），罗斯氏菌属（Roseburia）；脾虚湿热组丰度最高的前5 个属依次是拟杆菌属（Bacteroides），链球菌属（Streptococcus），埃希氏菌属/志贺氏菌属（Escherichia/Shigella），克雷伯氏菌属（Klebsiella），普氏菌属（Prevotella）；湿热内蕴组丰度最高的前5 个属依次是拟杆菌属（Bacteroides），埃希氏菌属/志贺氏菌属（Escherichia/Shigella），克雷伯氏菌属（Klebsiella），普拉梭菌属（Faecalibacterium），梭菌属XIVa（ClostridiumXIVa）；健康对照组丰度最高的前5 个属依次是拟杆菌属（Bacteroides），普氏菌属（Prevotella），普拉梭菌属（Faecalibacterium），罗斯氏菌属（Roseburia），克雷伯氏菌属（Klebsiella）。

图2 不同分组属水平上物种丰度组成柱状图

2.4 差异物种分析 组间差异性物种分别是产碱杆菌属（Alcaligenes）、气球菌属（Anaerococcus）、奇异菌属（Atopobium）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、柯林斯氏菌属（Collinsella）、镰刀菌属（Fusicatenibacter）、孪生球菌属（Gemella）、芽殖菌属（Gemmiger）、颗粒链菌属（Granulicatella）、纤毛菌属（Leptotrichia）、分枝杆菌属（Mogibacterium）、臭杆菌属（Odoribacter）、锥体菌属（Pyramidobacter）、罗氏菌属（Roseburia）、茄杆菌属（Solobacterium）、链球菌属（Streptococcus），见表2。

2.5 总生存期差异分析 用Log rank 法比较胰腺癌三种中医证型的总生存期差异，结果显示，脾虚湿热组的中位生存时间为8 个月（95%置信区间：4.167-11.833），比气血瘀滞组的12 个月（95%置信区间：8.013-15.987）和湿热内蕴组的18 个月（95%置信区间：5.658-30.342）都要短。三组的总生存期差异具有统计学意义（χ2=7.092，P=0.029），具体而直观的生存曲线图。

图3 生存曲线图

3 讨论

胰腺癌在古籍文献中虽未见直接记载，但根据其临床特点，可归于中医“伏梁”“积聚”“腹痛”“黄疸”等范畴[6]。胰腺癌的临床表现主要有腹痛、黄疸、消瘦、乏力以及食欲不振、腹胀、便秘或腹泻等消化系统的症状。对胰腺癌病因病机的认识，则不外乎内因（饮食不节、情志失度、病久虚损等）、外因（湿热侵袭等）两方面多因素复杂作用的结果[7]。关于胰腺癌的中医辨证分型，由于各医家所处气候、地域、生活习惯、风俗文化等的差异，及对胰腺癌病因病机的认识和临床经验的不同，目前尚无统一的辨证标准。金莉[5]通过回顾胰腺癌中医治疗的病因病机、试验研究和临床观察，总结了近十年来多位临床医家的经验，发现湿热内蕴证、气血瘀滞证和脾虚湿热证为胰腺癌的常见证型。这一结果与我们临床观察基本相符合，故我们将胰腺癌病人大致分为这三种证型。

近期大量论文和综述涵盖了包括肥胖、糖尿病、炎症性肠病、肝病、心脏代谢紊乱、神经退行性疾病及癌症在内的疾病，都存在着肠道微生物群的变化[8-13]。本研究的胰腺癌三种不同中医证型中，脾虚湿热组中的纤毛菌属（Leptotrichia）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、奇异菌属（Atopobium）、颗粒链菌属（Granulicatella）以及链球菌属（Streptococcus）的相对丰度较高（属于脾虚湿热组的差异物种），而在湿热内蕴组中的相对丰度则最低（除弯曲杆菌属外）。Ren等[14]首次通过MiSeq 测序方法分析了中国胰腺癌患者的肠道微生物结构特征，结果发现与健康对照组相比，弯曲杆菌属（Campylobacter）和纤毛菌属（Leptotrichia）在胰腺癌患者的粪便微生物中显著富集。此外，比较胰头癌伴胆总管阻塞患者组和胰头癌不伴有胆总管阻塞患者组的肠道微生物发现，胰头癌患者组较胰体胰尾癌患者组的链球菌属（Streptococcus）丰度显着增加，提示了链球菌属（Streptococcus）与肠道中的胆汁酸和脂质稳态有关。胰腺癌肠道菌群结构特征尚未见更多报道。然而，口腔微生物群与消化道微生物群重叠，并可通过循环转移至胰腺[15]。有学者使用16S rDNA 测序技术来研究胰头癌患者的舌苔微生物群结构特征发现，胰头癌患者的舌苔菌群多样性显著增加，主成分分析显示患者的舌苔菌群组成与健康人具有显著性差异，其中纤毛菌属（Leptotrichia）、奇异菌属（Atopobium）、弯曲杆菌属（Campylobacter）等13 个菌属在胰头癌患者的舌苔菌群中显著增加[16]。James Farrell 等[17]将胰腺癌患者组和健康对照组的唾液微生物群进行综合比较，发现与所有非癌症受试者相比，胰腺癌患者的颗粒链菌属（Granulicatella）中的Granulicatella adiacens 水平显著升高，流行病学研究表明口腔炎症（牙周炎）与胰腺癌发展的风险增加呈正相关[18]。链球菌属（Streptococcus）的牛链球菌（Streptococcus bovis）、溶血链球菌（Streptococcus gallolyticus subsp.）和巴氏杆菌（Pasteurianus）引起的菌血症和胰腺癌之间有关联，但仍有待进一步的研究[19-20]。其余的菌属暂未发现与胰腺癌发生发展的特异性和显著相关性。

表2 差异显著物及其丰度均值列表

肠道微生态也是一个阴阳平衡的整体。肠道菌群可以分为对人体有益的细菌和有害的细菌，在正常情况下，人体内两者处于相对平衡的状态，若两者比例失调则会导致肠道微生态的紊乱从而致病。从中医学角度来看，湿热内蕴证以湿热之邪实为主要矛盾，体内正气并未亏虚，正气尚能抵御外邪之扰，故而体内肠道的肠道微生态尚能维持相对平衡，此证型与健康人群肠道微生态结构最为接近（韦恩图中交集最多）。而脾虚湿热证患者虽有湿热之表象，但其病机的根本却是久病或攻伐消癥后中焦脾胃之气渐耗，以体内正气虚衰为主要矛盾，正虚则无以抵抗外邪，故而体内肠道的肠道微生态出现失衡，与健康人群肠道微生态结构差异较大（韦恩图中交集最少）。胰腺癌三种中医证型中，脾虚湿热组中纤毛菌属（Leptotrichia）、弯曲杆菌属（Camphlobacter）、奇异菌属（Atopobium）、颗粒链菌属（Granulicatella）以及链球菌属（Streptococcus）的丰度较高，其预后较差；而湿热内蕴组中的丰度最低（除弯曲杆菌属外），其预后较好。

本文研究显示，胰腺癌不同中医证型的肠道菌群结构差异及其预后具有一定的相关性。然而，肠道微生态是一个十分复杂的系统，饮食习惯、药物治疗、大便频率和规律等因素都是影响微生物群组成的因素，应予以考虑。所产生的改变也需要系统的、复杂的评价方法。此外，本研究存在样本量过小、分组不均衡、截尾样本率偏高等问题，后续研究需要进一步完善。