五叶山小橘叶化学成分的研究

2019-12-26陈玉年贺凤卢青秀滕海达杜艳

中南民族大学学报(自然科学版) 2019年4期

陈玉，年贺凤，卢青秀，滕海达，杜艳

(中南民族大学化学与材料科学学院，武汉 430074)

五叶山小橘(Glycosmispentaphylla)是芸香科(Rutaceae)山小橘属(Glycosmis)植物，为我国传统傣药，具有补土健胃、强身健体、除风通血止痛等功效[1].在东南亚传统医学中，也可以治疗咳嗽、风湿病、贫血、关节炎、黄疽等病症，以及用于预防各种癌症[2].现代药理研究表明五叶山小橘的提取物具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗增殖、抗突变、杀虫等生物活性[3].前期植物化学的研究表明，其主要的化学成分以生物碱、黄酮等结构类型为主[4-6].本课题组致力于傣药药效物质基础的研究[7]，前期研究了五叶山小橘茎的化学成分并从中分离得到的12个生物碱和18个非生物碱[8,9].为进一步扩大该植物的药用部位，本文采用溶剂提取法，正、反相硅胶柱和半制备高效液相色谱法从该植物叶的乙醇提取物中分离得到10个化合物，包含4个木脂素、3个生物碱、2个甾体以及1个萜类化合物，其结构分别鉴定为：山小橘新木脂烷甲素(1)、3,4-二-(4-羟基-3-甲基苯环)四氢呋喃(2)、表松脂醇(3)、松脂醇(4)、3-吲哚甲醛(5)、香草木宁(6)、山小桔碱(7)、pregnenolone(8)、16-dehydropregnenolone (9)、lochmolin E(10).其中化合物1为新的4,7-环氧-8,3-新木脂烷类化合物，化合物2～4、8～10是首次从该植物中分离得到.

1 仪器与材料

高效液相色谱仪(Ultimate 3000 半制备型，美国戴安，VWD，DAD 检测器)；色谱柱(半制备型，YMC-Pack ODS-A，250 mm × 10 mm，5 μm)；核磁共振波谱仪(AM-600/500型，德国Bruker)；电子天平(AX224ZH/ E型，常州奥豪斯仪器)；高分辨质谱仪(Q Exactive，赛默飞世尔科技)；三用紫外分析仪(ZF-I型，上海顾村电光)；旋转蒸发仪(RE2000A型，上海亚荣生化)；循环水式多用真空泵(SHB-111A型，上海贝菌科技)；柱色谱硅胶(80～100目，国药集团)；柱色谱硅胶(200～300、300～400目，青岛海洋化工)；反相硅胶(50 μm,YMC·GEL ODS-A-HG,AAG12S50)；硅胶板(GF 254型，青岛海洋化工).

石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇(分析纯，国药集团)；95%工业乙醇、甲醇(色谱级，Sigma)；乙腈(色谱级，中国昌泰兴业)，HPLC洗脱溶剂：A=乙腈；B=甲醇；C=1‰甲酸水溶液.五叶山小橘叶采于云南西双版纳，经云南西双版纳傣族自治州民族医药研究所赵应红主任药师鉴定为芸香科山小橘属植物五叶山小橘Glycosmispentaphylla(Retz.)Correa 的叶.

2 提取与分离

取干燥五叶山小橘叶12 kg经粉碎后用90%乙醇室温浸提3次，每次24 h，提取液真空抽滤后减压旋蒸得乙醇提取物(860 g).乙醇提取物用一定量的甲醇溶解后用等量的石油醚分三次萃取，得石油醚组分(100 g)和甲醇组分(740 g).甲醇组分经过聚酰胺柱层析，采用水-乙醇为流动相梯度洗脱(1∶0,7∶3,5∶5,3∶7,0∶10)，TLC检测合并得到5个组分(Fr.1～Fr.5).Fr.2(90 g)经硅胶柱层析(200～300目)分离，二氯甲烷-甲醇(100∶1,20∶1,9∶1,8∶2)梯度洗脱以及TLC检测后合并得到13个组分(Fr.2.1～Fr.2.13).Fr.2.5(9.27 g)经50m反相硅胶柱分离，水-甲醇梯度洗脱(7∶3,1∶1,3∶7,0∶1)以及TLC检测后合并得7个组分(Fr.2.5.1～Fr.2.5.7).Fr.2.5.1经HPLC反复制备得到化合物1[2 mg,V(A)∶V(C)=39∶61,tR=23 min],2[3.9 mg,V(A)∶V(C)=36∶64,tR=23 min]，3[3.6 mg,V(A)∶V(C)=34∶66,tR=19 min],4[2.2 mg,V(B)∶V(C)=52∶48,tR=13 min],5[2 mg,V(A)∶V(C)=32∶68,tR=12 min],6[4.2 mg,V(A)∶V(C)=36∶64,tR=19 min],7[3 mg,V(A)∶V(C)=48∶52,tR=18 min],10[1.5 mg,V(A)∶V(C)=39∶61,tR=21 min].Fr.2.5.4(0.5 g)经硅胶柱层析分离以及TLC检测后合并得8个组分(Fr.2.5.4.1～Fr.2.5.4.8).Fr.2.5.4.2经HPLC[流动相V(B)∶V(C)=52∶48,流速3 mL/min]分离得到化合物8(0.8 mg,tR=14 min)，9(2.4 mg,tR=15 min).化合物1～10的结构式见图1.

图1 化合物1～10的结构式Fig.1 Structural formulas for compounds 1—10

3 结构鉴定

图2 化合物1的主要HMBC和ROESY相关Fig.2 Structure and key HMBC and ROESY correlations of compound 1

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR 数据(600/150 MHz,CD3OD)Tab.1 1H NMR and 13C NMR data of compound 1

化合物2:白色粉末，分子式为C20H24O5.1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH:6.68(2H,d,J=7.8 Hz,H-5,H-5′),6.54(2H,dd,J=1.8,8.4 Hz,H-6,H-6′),6.60(2H,d,J=1.2 Hz,H-2,H-2′),3.80(2H,dd,J=6.6,8.4 Hz,H-9a,H-9a′),3.79(6H,s,OCH3-3,OCH3-3′),3.51(2H,dd,J=6.0,8.4 Hz,H-9b,H-9b′),2.52(2H,dd,J=6.6,13.2 Hz,H-7b,H-7b′),2.50(2H,dd,J=7.2,13.2 Hz,H-7a,H-7a′),2.19(2H,m,H-8,H-8′).13C NMR(150 MHz,CD3OD)δC: 149.0(C-3,C-3′),145.9(C-4,C-4′),133.5(C-1,C-1′),122.3(C-6,C-6′),116.1(C-5,C-5′),l13.4(C-2,C-2′),74.5(C-9,C-9′),57.6(OCH3),47.8(C-8,C-8′),40.1(C-7,C-7′).上述数据与文献[12]报道基本一致，故鉴定化合物2为3,4-二(4-羟基-3-甲基苯环)四氢呋喃.

化合物3:无色颗粒状晶体，分子式为C20H22O6.1H NMR(600 MHz,CDCl3)δH: 6.93(1H,s,H-2′),6.89(1H,s,H-2),6.76(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.87(2H,dd,J=1.8,7.2 Hz,H-6,6′),6.82(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),5.59(1H,s,OH-4 or 4′),5.56(1H,s,OH-4 or 4′),4.84(1H，d，J=5.4 Hz，H-7′),4.40(1H,d,J=6.0 Hz,H-7),4.10(1H,d,J=9.6 Hz,H2-9 ax),3.90(3H,s,OMe),3.88(3H,s,OMe),3.82(2H,d,J=9.0 Hz,H2-9eq,9′eq),3.31(2H,m,H2-9′ax,H-8′),2.88(1H,m,H-8).13C NMR(150 MHz,CDCl3)δC: 133.2(C-1),130.5(C-1′),108.5(C-2′),108.7(C-2),146.6(C-3′),146.9(C-3),144.8(C-4′),145.5(C-4),114.4(C-5,5′),119.4(C-6),118.6(C-6′),82.3(C-7′),87.9(C-7),50.3(C-8′),54.7(C-8),69.9(C-9′),71.1(C-9),56.2(2OMe).上述数据与文献[13]对照基本一致,故鉴定化合物3为表松脂醇.

化合物4:白色粉末，分子式为C20H22O6.1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH: 6.95(2H,s,H-2,2′),6.77(2H,d,J=8.4 Hz,H-5,5′),6.81(2H,dd,J=1.8,7.2 Hz,H-6,6′),4.71(2H,d,J=4.2 Hz,H-7,7′),4.23(2H,dd,J=9.0,3.6 Hz,H-9 ax,9′ax),3.86(6H,s,2OMe),3.84(2H,dd,J=9.0,3.6 Hz,H-9eq,9′eq),3.15(2H,m,H-8,8′).13C NMR(150 MHz,CD3OD)δC: 133.9(C-1,1′),111.1(C-2,2′),149.3(C-3,3′),147.5(C-4,4′),116.2(C-5,5′),120.2(C-6,6′),87.7(C-7,7′),56.5(C-8,8′),72.7(C-9,9′),55.5(2OMe).上述数据与文献[14]对照基本一致，故鉴定化合物4为松脂醇.

化合物5:白色晶体，分子式为C9H7NO.1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH: 8.11(1H,s,NH),9.89(1H,s,CHO),8.16(1H,d,J=7.8 Hz,H-4),7.26(2H,m,H-5,6),7.48(1H,d,J=8.4 Hz,H-7).13C NMR(150MHz,CD3OD)δC:139.1(C-2),120.3(C-3),187.6(-CHO),125.9(C-4a),125.2(C-4),123.8(C-5),122.6(C-6),113.3(C-7),139.9(C-7a).上述数据与文献[15]对照基本一致，故鉴定化合物5为3-吲哚甲醛.

化合物6:白色固体，分子式为C14H13NO4.1H NMR(600 MHz，CD3OD)δH: 7.44(1H,s,H-5),7.28(1H,s,H-8),7.72(1H,s,H-2′),7.17(1H,s,H-3′),4.46(3H,s,4-OCH3),3.97(3H,s,6-OCH3),3.94(3H,s,7-OCH3).13C NMR(150 Hz,CD3OD)δC: 164.5(C-2),114.1(C-3),157.8(C-4),101.7(C-5),154.6(C-6),149.4(C-7),106.5(C-8),103.6(C-4a),143.2(C-8a),144.0(C-2′),106.4(C-3′),60.0(4-OCH3),56.5(6-OCH3),56.4(7-OCH3).以上数据与文献[16]报道基本一致，故确定化合物6为香草木宁.

化合物7:黄色晶体，分子式为C16H15NO4.1H NMR(600 MHz,CDCl3)δH:8.43(1H,d,J=7.8 Hz,H-8),7.28(1H,t,J=7.2 Hz,H-7),7.71(1H,t,J=7.2Hz,H-6),7.50(1H,d,J=7.2 Hz,H-5),6.26(1H,s,H-4),4.00(3H,s,2-OCH3),3.91(3H,s,3-OCH3),3.83(3H,s,N-CH3),14.75(1H,s,1-OH).13C NMR(150 MHz,CDCl3)δC: 156.5(C-1),130.5(C-2),159.5(C-3),87.0(C-4),114.8(C-5),134.2(C-6),121.7(C-7),127.0(C-8),181.1(C-9),140.8(C-4a),142.3(C-5a),121.0(C-8a),106.1(C-9a),56.2(2-OCH3),61.0(3-OCH3),34.4(N-CH3).以上数据与文献[16]报道基本一致，故鉴定化合物7为山小桔碱.

化合物8:白色片状结晶，分子式为C21H32O2.1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH: 5.35(1H,m,H-6),3.40(1H,m,H-3),2.65(1H,t,J=9.0 Hz,H-17),2.13(3H,s,H3-21),1.03(3H,s,H3-19),0.63(3H,s,H3-18).13C NMR(150 MHz,CD3OD)δC: 212.6(C-20),142.4(C-5),122.4(C-6),72.5(C-3),64.8(C-17),58.3(C-14),51.7(C-9),45.3(C-13),40.0(C-12),38.7(C-1),43.1(C-4),33.4(C-8),33.0(C-7),31.8(C-21),37.9(C-10),25.6(C-15),23.9(C-16),13.7(C-18),20.0(C-19).以上数据与文献[17]报道基本一致，鉴定化合物8为孕烯醇酮.

化合物9:白色片状结晶，分子式为C21H30O2.1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH: 5.37(1H,m,H-6),3.41(1H,m,H-3),6.91(1H,dd,J=1.8,3.6 Hz,H-16),2.26(3H,s,H3-21),1.07(3H,s,H3-19),0.93(3H,s,H3-18).13C NMR(150 MHz,CD3OD)δC: 199.6(C-20),142.8(C-5),122.2(C-6),72.5(C-3),156.5(C-17),58.0(C-14),52.3(C-9),47.4(C-13),36.1(C-12),38.6(C-1),43.2(C-4),31.7(C-8),32.4(C-7),27.3(C-21),38.0(C-10),33.4(C-15),147.6(C-16),16.3(C-18),19.9(C-19).以上数据与文献[18]报道基本一致，鉴定化合物9为16-妊娠双烯醇酮.

化合物10:无色油状物，分子式为C15H24O3.1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH:2.17(2H,dd,J=3.9,9.3 Hz,H-2),1.71(1H,m,H-3a),1.93(1H,m,H-3b),1.67(1H,d,J=12.0 Hz,H-5),0.49(1H,dd,J=9.6,12.0 Hz,H-6),0.75(1H,m,H-7),2.04(2H,m,H2-8),2.24(1H,dd,J=6.0,13.2,H-9a),2.57(1H,t,J=13.2,H-9b),1.06(3H,s,H3-12),0.99(3H,s,H3-13),4.85(1H,m,H-14a),4.89(1H,m,H-14b),1.26(3H,s,H3-15).13C NMR(150 MHz,CD3OD)δC: 97.1(C-1),30.1(C-2),40.9(C-3),81.7(C-4),58.7(C-5),23.4(C-6),29.1(C-7),26.7(C-8),35.1(C-9),154.4(C-10),20.9(C-11),29.4(C-12),16.1(C-13),111.9(C-14),27.5(C-15).以上数据与文献[19]报道基本一致，鉴定化合物10为lochmolin E.

4 结语

前期对五叶山小橘叶的分离主要得到生物碱[3,20]，本文对五叶山小橘叶进行系统分离，除了得到3个生物碱外，还得到4个木脂素、2个甾体、1个萜类.分别鉴定为：山小橘新木脂烷甲素 (1)、3,4-二(4-羟基-3-甲基苯环)四氢呋喃 (2)、表松脂醇(3)、松脂醇(4)、3-吲哚甲醛 (5)、香草木宁(6)、山小桔碱(7)、pregnenolone(8)、16-dehydropregnenolone (9)、 lochmolin E(10).其中化合物1为新的4′,7-环氧-8,3′新木脂烷类化合物，化合物2～4、8～10是首次从该属植物中分离得到.化合物10原是从海洋生物软珊瑚中分离得到，这是首次从陆生植物中分离得到.木脂素、甾体、萜类化合物的分离，说明了五叶山小橘叶化学成分呈现结构多样性，为进一步研究和开发五叶山小橘叶提供了理论依据.