皂角刺配方颗粒HPLC指纹图谱研究

姚 娜，黄燕明，陈桂生，李雪银，康志英

(1.广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510663；2.宁夏隆德县六盘山中药资源开发有限公司，宁夏 固原 756300)

皂角刺为豆科植物皂荚GleditsiasinensisLam.的干燥棘刺。全年均可采收，干燥或趁鲜切片干燥。其具有消肿托毒、排脓、杀虫的功效。临床上用于痈疽初起或脓成不溃；外治疥癣麻风[1]。皂角刺中的主要化学成分研究有相关报道，其中皂角刺饮片含有黄酮类、皂荚皂苷类、氨基酸类、酚类、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚甾醇、谷甾醇以及二十九碳烷等成分[2-4]；皂角刺的水提取液中含有黄酮、皂苷、酚类、有机酸、糖或苷类等化合物[5]。据文献可知，皂角刺具有抑菌、抗病毒、提高免疫力、抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、抑制血栓形成、抑制静脉血管内皮细胞增殖等作用[6-7]。中药配方颗粒也叫免煎中药饮片，它具有安全、稳定、方便、快捷的特点。皂角刺配方颗粒是以皂角刺饮片为原料，经水提、分离、浓缩、干燥、制粒、包装等工艺制备而成。由于皂角刺配方颗粒是经过多道工序制备而成，已不再具备饮片的性状与结构特征。为了更全面、准确地评价皂角刺配方颗粒的质量，本文采用HPLC-DAD法对其指纹图谱方法进行研究，结果该方法稳定性、重复性好，可作为皂角刺配方颗粒质量控制方法。

1 仪器与试药

十万分之一电子分析天平(MS205DU，瑞士Mettler toledo公司)；超纯水器(Simplicity，美国密理博Millipore公司)；数控超声波清洗器(KQ500DE，昆山市超声仪器有限公司)；Ultimate3000 DIONEX高效液相色谱仪；Agilent 1200高效液相色谱仪。

皂角刺对照药材(中国食品药品检定研究院，121210-201003，规格：1 g/瓶)；乙腈为色谱级；甲醇、正丁醇、氨水均为分析纯。

10批皂角刺配方颗粒均来自广州市香雪制药股份有限公司(批号依次为01～10)；麦芽糊精来自中粮生化能源(公主岭)有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25 cm，内径为4.6 mm，粒径为5 μm)；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203 nm；柱温30 ℃。见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.2 参照物溶液的制备

取皂角刺对照药材适量，精密称定，加水适量，回流提取1 h，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取皂角刺配方颗粒约1 g，研细，精密称定，置锥形瓶中，加入1 g硅藻土，混匀，精密加入甲醇10 mL，超声处理30 min(功率300 W，频率40 kHz)，过滤，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，转移至分液漏斗中，加入氨水10 mL、正丁醇20 mL，充分振摇，静置，分层，分取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.4 测定法

分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱。

2.5 10批样品的检测结果

分别取10批皂角刺配方颗粒，按“2.3”项下方法制备10份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定，得到10批皂角刺配方颗粒的色谱叠加图，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.1版》对10批皂角刺配方颗粒指纹图谱进行计算，相似度达0.997以上。结果见图1-图2和表2。

图1 10批皂角刺配方颗粒HPLC特征图谱叠加

图2 皂角刺配方颗粒HPLC指纹图谱共有模式

表2 10批皂角刺配方颗粒HPLC指纹图谱的相似度评价结果

2.6 指纹图谱中共有峰的确认

通过对10批皂角刺配方颗粒的HPLC指纹图谱进行分析，有9个色谱峰能稳定重现，故确立了9个共有峰。经与皂角刺对照药材进行比对，4-9号共有峰的保留时间及紫外光谱与皂角刺对照药材均吻合。Zhou L等[8]从皂角刺中分离得到黄酮类成分——表儿茶素。黄桂华[9]对皂角刺的饮片进行了紫外光谱扫描，邹盛勤等[10]和徐春玉[11]对表儿茶素进行了紫外光谱扫描，其图谱形状以及最大吸收波长均与上述共有峰的紫外光谱相似。故推测上述共有峰为皂角刺的表儿茶素类成分，且其峰面积均大于总峰面积的3%，因此拟定4～9号共有峰为特征峰1～6号。

2.7 特征图谱方法学考察

2.7.1 专属性试验 取皂角刺配方颗粒、麦芽糊精及皂角刺对照药材分别按“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下的色谱条件测定，见图3，结果表明，6个共有色谱峰的鉴定均不受溶剂及辅料等因素干扰，具有良好的专属性。

A．皂角刺配方颗粒，B．阴性对照，C．空白溶剂，D．皂角刺对照药材

2.7.2 精密度试验 取同一批皂角刺配方颗粒供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件于高效液相色谱仪上连续进样6次，记录色谱图，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.1版》进行相似度评价，结果各图谱共有峰与对照指纹图相似度均达1.000，表明该仪器精密度良好。

2.7.3 重复性试验 取同一批皂角刺配方颗粒样品，平行6份，按“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下的色谱条件分别进样，记录色谱图。结果各图谱特征峰的相似度均达0.999以上，表明该方法重复性良好。

2.7.4 稳定性试验 取同一份皂角刺配方颗粒供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12、24、48 h进样，记录色谱图，结果各图谱共有峰的相似度均达0.999以上，表明该供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.7.5 中间精密度试验 分别考察不同分析人员、不同日期、不同设备对精密度的影响，结果各图谱共有峰的相似度均达0.998以上，表明该方法中间精密度良好，随机变动因素不影响该方法精密度。

2.7.6 耐用性实验 取同一批皂角刺配方颗粒供试品，按“2.3”项下方法处理样品，分别使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)三种型号的色谱柱，按上述色谱条件分别进样，记录色谱图。结果在不同色谱柱因素变动的条件下，各图谱共有峰的相似度均达0.980以上，表明该方法耐用性良好。

3 讨论

本研究对不同实验条件进行优化，考察了不同的流动相体系，包括乙腈-0.5%磷酸，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-水等；全波长扫描考察了不同波长下供试品的指纹图谱。最终选取在203 nm下，乙腈-水梯度洗脱，该条件下谱图色谱峰信息丰富，分离度好，稳定性好，适合指纹图谱研究要求。

根据相似度计算软件得到10批皂角刺配方颗粒的对照图谱及各批样品与对照图谱之间的相似度，结果均大于0.98，表明各批次样品之间相关性较好，投料所用皂角刺原药材质量较稳定，皂角刺配方颗粒工艺稳定。

综上所述，本实验中建立的采用HPLC法检测皂角刺配方颗粒指纹图谱方法的稳定性、重复性好，为皂角刺配方颗粒质量控制和评价提供了参考。