Box-Behnken响应面法优化烫狗脊炮制工艺

李 丹，王小康，吴建伟，张志超，刘江红

(深圳市龙华区中心医院 药学部，广东 深圳 518110)

狗脊为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotiumbarometz(L.)J.Sm.的干燥根茎，其主要成分为酚酸类、黄酮类、皂苷类、挥发油及多糖[1-2]。现代药理学研究表明狗脊具有抗骨质疏松、抑菌抗炎、抗风湿、抗氧化及保肝等多种药理活性[3-6]。狗脊具有祛风湿、补肝肾、强腰膝多种功效，临床主要用于风湿痹痛、腰膝酸软、下肢无力等症的治疗[7]。《中药炮制经验集成》一书记载，狗脊的炮制方法主要有酒蒸、炒焦、砂烫、土炒、酒炒、酒砂炒、盐水煮等[8]。烫狗脊为2015年版《中国药典》狗脊项下唯一收载的炮制品，但是目前鲜见对烫狗脊炮制规范的研究报道。在已报道的文献中存在关键炮制工艺参数尚不明确等问题，如砂量比、砂烫时间、砂烫温度等，并且炮制工艺参数在不同文献中也有很大差异[9-10]，不利于烫狗脊的规范化生产。因此，本研究以烫狗脊中原儿茶酸的含量为评价指标，采用单因素考察结合Box-Behnken响应面设计的方法对烫狗脊的炮制工艺进行研究，为规范烫狗脊的炮制工艺提供科学依据。

1 仪器与材料

Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Milli-Q Direct超纯水仪(默克股份有限公司)；BP211D电子分析天平(德国赛多利斯公司)；KQ5000-DE超声波清洗仪(昆山仪器股份有限公司)；乙腈、冰乙酸(默克股份有限公司，色谱纯)；水为超纯水；甲醇试剂为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司)；原儿茶酸对照品(批号2 110753-201817)，狗脊药材采自广东省肇庆市，由深圳市龙华区中心医院药学部刘江红副主任药师鉴定为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotiumbarometz(L.)J.Sm.的干燥根茎，用于烫狗脊的炮制研究。

2 方法与结果

2.1 原儿茶酸的定量分析方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-1%冰乙酸(5∶95)进行等度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.1.2 对照品溶液制备 取原儿茶酸对照品适量，精密称定，置于容量瓶中，用甲醇-1%冰乙酸(70∶30)配制成质量浓度为534.86 g·mL-1的对照品储备液。精密量取上述对照品储备液适量，置于容量瓶中，加甲醇-1%冰乙酸(70∶30)配制成质量浓度分别为267.43、133.72、66.86、33.43、16.71 g·mL-1的系列对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备 取本品粉末(过三号筛)约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液25 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察 取“2.1.2”项下系列对照品溶液，按“2.1.1”项下的条件进行测定，以质量浓度C(g·mL-1)为横坐标，峰面积A为纵坐标，计算原儿茶酸的线性回归方程。结果显示，回归方程为Y=985.18X+931.25，r=0.999 5，表明原儿茶酸在16.71～534.86 g·mL-1的浓度范围内呈良好的线性关系，见图1。

2.2.2 精密度试验 取“2.1.2”项下对照品溶液1份，按照“2.1.1”项下条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示原儿茶酸峰面积RSD为0.34%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性试验 取同一批烫狗脊样品，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1.1”项下的色谱条件进样测定，计算原儿茶酸的含量。结果显示原儿茶酸的含量RSD为0.75%，表明该方法的重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 取同一批烫狗脊供试品溶液，分别于 放置0、3、6、9、18、24 h后，按“2.1.1”项下的色谱条件进样测定，结果显示原儿茶酸的峰面积RSD为0.65%，表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好。

2.2.5 加样回收率试验 取已知含量的烫狗脊样品3份，每份 0.5 g，分别按供试品中原儿茶酸含量的50%、100%、150%精密加入对照品，每个质量浓度平行测定3份，按“2.1.3”项下方法分别制备供试溶液，再按照“2.1.1”色谱条件进样测定。根据标准曲线计算各成分的含量，并计算加样回收率。结果显示原儿茶酸的平均加样回收率为96.45%，RSD为1.01%，表明本方法加样回收率良好。

图1 原儿茶酸的标准曲线

a.原儿茶酸

2.3 单因素试验

2.3.1 不同砂量比 准确称取狗脊药材6份，每份50 g，固定其他条件，考察砂量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1对原儿茶酸含量的影响。砂量比的大小将会影响药材的均匀受热，因此最终会影响药材的炮制质量。由图3可以发现，当砂量倍数为4∶1时，原儿茶酸的含量达到最大，然而随着砂量比的增大，原儿茶酸的含量趋于饱和。

图3 砂量比对原儿茶酸含量的影响(n=3)

2.3.2 不同砂烫时间 准确称取狗脊药材5份，每份50 g，固定其他条件，考察砂烫时间2、4、6、8、10 min对原儿茶酸含量的影响。由图4可以发现，砂烫6 min时原儿茶酸的含量达到最大，随着砂烫时间的增加，原儿茶酸的含量反而有减小的趋势。这可能是随着炮制时间的增加，炮制品断面颜色逐渐加深出现焦糊，导致有效成分碳化分解[11]。

图4 砂烫时间对原儿茶酸含量的影响(n=3)

2.3.3 不同砂烫温度 准确称取狗脊药材5份，每份50 g，固定其他条件，考察砂烫温度150、180、210、240、270、300 ℃对原儿茶酸含量的影响。由图5可以发现，当温度为210 ℃时原儿茶酸的含量达到最大，随着温度的增加，原儿茶酸的含量反而减小。推测为随着温度的升高，炮制品容易焦化，导致有效成分碳化分解[11]。

图5 砂烫温度对原儿茶酸含量的影响(n=3)

2.4 Box-Behnken响应面法优化试验设计

2.4.1 建立模型及方差分析 为了得到烫狗脊的最佳炮制工艺参数，继续采用Box-Behnken响应面法对单因素考察结果再进一步优化。以砂量比(A)、砂烫时间(B)和砂烫温度(C)作为自变量，选取3个水平(0，±1)建立模型对烫狗脊的炮制工艺进行优化，实验因素及水平设计见表1，试验结果见表2。

表1 Box-Behnken设计因素及水平

表2 Box-Behnken实验设计及结果

续表2 Box-Behnken实验设计及结果

表3 回归模型方差分析

注：**P<0.01，差异显著；*P<0.05，差异显著。

2.5 最优炮制工艺预测及验证试验

根据建立二次回归方程模型及响应面图，预测到烫狗脊的最佳炮制工艺为砂量比4.67∶1、砂烫时间为5.87 min、砂烫温度177.99 ℃，预测原儿茶酸的含量为0.931 mg/g。考虑到实际操作，炮制工艺调整为砂量比4.5∶1、砂烫时间为6 min和砂烫温度180 ℃，其中预测的砂烫温度在2015版《中国药典》四部通则推荐的温度范围之内，证明该优化条件的合理性。此外，根据以上条件进行3次炮制工艺平行验证，原儿茶酸的含量分别为0.941 mg/g、0.949 mg/g、0.952 mg/g，含量均值为0.947 mg/g，RSD为0.66%。实测值与预测值基本一致，偏差率小于1%，说明所建立模型基本可靠。

图6 砂量比(A)、砂烫时间(B)和砂烫温度(C)对原儿茶酸含量(Y)交互作用响应面

3 结论

2015年版《中国药典》以原儿茶酸作为烫狗脊的含量测定指标。本研究前期实验发现炮制过程中烫狗脊原儿茶酸的含量主要受砂量比、砂烫时间、砂烫温度的影响较大，各因素之间对原儿茶酸的含量也存在着交叉影响。砂烫时间过久或温度过高均会引起炮制品碳化，导致有效成分分解，说明寻找合理的炮制参数是非常关键的。因此，本研究通过Box-Behnken响应面法对单因素考察结果进一步优化，所建立模型总决定系数r2=0.982 1，模型拟合度高并且能解释98.21%的试验数据变异性，可以较好地预测烫狗脊原儿茶酸与砂烫温度、砂烫时间、砂烫温度之间的变化关系。各因素对原儿茶酸含量的影响顺序为：砂烫时间>砂烫温度>砂量比。根据模型预测到烫狗脊的最优炮制工艺为砂量比4.67∶1、砂烫时间为5.87 min、砂烫温度177.99 ℃，预测原儿茶酸的含量为0.931 mg/g。通过实验进一步验证设计方案的可靠性，实测值与预测值的偏差率较小，建立模型基本可靠，可为规范烫狗脊的炮制工艺提供更多的科学依据。