基于一测多评法的复方丹参片质量评价研究

廖晓虎，潘其麟，王晓晓，邱栋樑，李祥兰，李茂森

(德阳市食品药品安全检验检测中心，四川 德阳 618000)

复方丹参片由丹参、三七和冰片三味中药组成，具有活血化瘀、理气止痛的功效，可用于治疗气滞血瘀所致的胸痹、冠心病和心绞痛等疾病[1，2]。2015年版《中国药典》以丹参酮IIA、丹酚酸B、三七总皂苷(人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re和三七皂苷R1的总量计)作为复方丹参片的质量控制指标[1]。丹参作为复方丹参片的君药，来源于唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根茎[3]，以丹参酮类为代表的脂溶性成分是其主要有效成分，具有广泛的药理活性，根据其不同的化学结构分为丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、隐丹参酮等[4，5]；复方丹参片中此类成分主要发挥保护心肌细胞免受心肌缺血再灌注损伤，改善心脏功能，促进梗塞后心肌重构等作用[9-11]。

中药多成分的含量测定方法长期以来一直面临着对照品、生产品分离难度大，单体不稳定，货源紧缺，价格昂贵等问题。一测多评法通过建立样品中某一易得、稳定、有效的典型成分与其他成分间的相对校正因子(fi/s)以计算其他成分的量，实现了多成分的同步测定[6-8]。目前，《中国药典》2015年版已将同步测定法用于丹参药材、咳特灵胶囊等药物的多成分测定。本研究将丹参酮类的代表成分丹参酮ⅡA、15，16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I作为研究对象，以丹参酮ⅡA为内标，通过计算此成分与其余3个成分(15，16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I)间的相对校正因子，建立复方丹参片一测多评的方法，对复方丹参片进行质量评价。并运用统计学方法进行相关性分析，以期为复方丹参片的质量评价提供参考。

1 仪器与材料

UltiMate 3000型超高效液相色谱仪(美国)；Agilent 1260型超高效液相色谱仪(美国)；岛津LC-2030液相色谱仪(日本)；METTLER TOLEDO XS205型电子天平(美国)；KQ-700DV型双频数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

色谱柱：TechMate C18-ST柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

15，16-二氢丹参酮I(批号：00020044-611)对照品由美国ChromaDex提供；隐丹参酮(批号为 110852-201807，质量分数为99.0%)、丹参酮I(批号为110867-201607)和丹参酮IIA(批号为110766-201721，质量分数为99.5%)对照品，均购自中国食品药品检定研究院。

乙腈、甲醇均为色谱纯；乙醇、磷酸均为分析纯；超纯水由ULUP-IV-10T型超纯水器(四川优普超纯科技有限公司)制备。103批次复方丹参片样品均来自2018年四川省食品药品监督管理局药品评价性抽样，见表1。

2 方法

2.1 色谱条件

以Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)为色谱柱；流动相A为乙腈，流动相B为0.02%磷酸，梯度洗脱(0～6 min，61% A；6～20 min，61%A～90% A；20～20.5 min，90% A～61%A；20.5～25 min，61% A)。流速1.0 mL/min；柱温20 ℃；进样量10 μL；检测波长270 nm。在上述色谱条件下，4种成分的色谱峰分离度良好，见图1。

注：1为15，16-二氢丹参酮I；2隐丹参酮；3丹参酮I；4丹参酮IIA

续表1 复方丹参片样品信息与外标法和一测多评测定丹参酮类成分的含量及综合得分 (mg·g-1)

2.2 对照品溶液的制备及线性范围考察

分别取15，16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA对照品各适量，精密称定，置同一100 mL量瓶中；加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品贮备液。分别精密吸取混合对照品储备液0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得到这4种对照品的7个不同浓度的混合对照溶液。按拟定方法注入高效液相色谱仪，以峰面积和对应浓度(μg·mL-1)进行线性回归，得到各个成分的回归方程。结果显示，这4个成分在线性范围内呈良好的线性关系，见表2。

表2 药效成分的线性回归方程

2.3 供试液的制备

取复方丹参片10片(糖衣片除去糖衣)，研成细粉，取细粉约1 g，精密称定，置于150 mL锥形瓶中，准确加入25 mL甲醇，称重，超声(100 W，45 kHz)15 min，放冷，补足失重。0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度考察 取同一供试品溶液，连续进样6针，测定这4种药效成分的峰面积。15，16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的RSD均≤0.47%，表明仪器的精密度良好。

2.4.2 重复性考察 取同一样品的粉末，6份，按“2.3”项下方法制备成供试品溶液，测定这4种药效成分的峰面积，并计算其含量。15，16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA含量的RSD均≤0.87%，表明方法的重复性良好。

2.4.3 稳定性考察 取1份供试品溶液，于制样后0、2、4、8、12、24、48 h按拟定方法进样，结果15，16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA峰面积的RSD分别为1.56%、0.97%、1.08%、0.62%(n= 7)。表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.4.4 回收率考察 精密称取0.5 g已知这4种药效成分含量的复方丹参片粉末6份，分别加入与样品中这些药效成分含量大致相当的对照品贮备液，再按“2.3”项方法制备成供试品溶液，进样测定。15，16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA的平均回收率分别为106.14%、101.47%、98.29%、102.08%(n=6)，其RSD分别为4.06%、1.30%、1.24%、2.03%，表明所建立的方法准确性良好。

2.5 样品含量的测定

称取每份复方丹参片样品的粉末2份，按“2.3”项方法制备供试品溶液，再按“2.1”色谱条件测定这4种药效成分的峰面积。根据回归方程计算这4种药效成分在供试品中的含量(mg·g-1)，结果见表1。

3 结果与讨论

3.1 一测多评质量评价模式的建立

3.1.1 相对校正因子的计算 目前，对fi/s的计算多采用多点校正法和斜率校正法，这2种算法在计算过程中略有差异。多点校正法通过公式fi/s=(Ai/Ci)/(As/Cs)计算各成分的fi/s，式中Ai为待测成分i的峰面积，As为内参物s的峰面积，Ci为待测成分的浓度或质量，Cs为内参物的浓度或质量。样品中待测成分量的计算公式为Ci′=Cs′Ai′/(fi/sAs′)，式中Ai′为样品中待测成分i的峰面积，As′为样品中内参物s的峰面积，Ci′为样品中待测成分i的浓度或质量，Cs′为样品中内参物s的浓度或质量[6]。在待测成分标准曲线A=aC+b中，采用斜率校正法计算fi/s，公式为fi/s=ai/as，式中ai为待测成分i斜率，as为内参物s斜率。样品中待测成分量的计算公式为Ci′=Ai′/(fi/sas)，式中Ai′为样品中待测成分i的峰面积，Ci′为样品中待测成分i的质量[7，8]。

本实验以丹参酮IIA为内参物，比较了在岛津LC-2030色谱仪与waters Symmetry C18色谱柱条件下2种不同算法对fi/s的影响，结果发现2种算法计算结果无显著性差异，见表3。考虑到斜率校正无需逐个浓度计算平均fi/s，且在样品指标成分量计算过程中更为简便，因此，在后续实验中采用斜率校正法建立的fi/s进行计算。

表3 不同计算方法得到的fi/s

3.1.2 校正因子耐用性考察 本研究考察了Aglient 1260、UltiMate 3000和岛津LC-2030这3种不同高效液相色谱系统和3种不同品牌、同类填料的色谱柱TechMate C18-ST柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)、Waters Symmetry C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)、Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，结果见表4、表5。RSD均小于3.0%，说明不同色谱柱对待测成分校正因子无显著影响；相对校正因子在使用不同仪器时的耐用性较好。

表4 不同色谱系统下3个药效成分的相对校正因子

此外，本研究还采用岛津LC-2030高效液相色谱系统，Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，分别考察了不同流速(0.9、1.0、1.1 mL·min-1)和不同柱温(18 ℃、20 ℃、22 ℃)对相对校正因子的影响，结果见表6、表7。RSD≤2.0%，说明流速和柱温微小变化时，校正因子波动较小，说明相对校正因子的重现性良好。

表5 不同色谱柱3个药效成分的相对校正因子

表6 不同体积流量对3个药效成分的相对校正因子的影响

注：3个药效成分分别相对于内参物丹参酮IIA的校正因子。

表7 不同柱温对3个药效成分的相对校正因子的影响

注：3个药效成分分别相对于内参物丹参酮IIA的校正因子。

3.1.3 一测多评法待测色谱峰的定位 为了在仅采用丹参酮IIA为对照品时，能够确认丹参酮I、隐丹参酮和15，16-二氢丹参酮I色谱峰的位置，从而通过获得的相对校正因子同时计算3种成分的量，达到一测多评的目的，本研究考察了采用不同仪器和色谱柱时丹参酮I、隐丹参酮和15，16-二氢丹参酮I色谱峰与丹参酮IIA色谱峰间的保留时间差和相对保留时间2个参数，结果见表8、表9。结果表明，其他待测成分与丹参酮IIA保留时间差的RSD在4.6%～9.5%之间，相对保留值的RSD在1.4%～2.0%之间。可见，与丹参酮IIA色谱峰的保留时间差和相对保留时间均可作为其他3个待测成分色谱峰的定位参数，相对保留时间较保留时间差的变异更小，所以可以采用相对保留时间作为色谱峰的定位。

表8 保留时间差考察结果

表9 相对保留时间考察结果

3.1.4 内参物的选择 以外标法的测定结果(Ws)为标准，评价一测多评法计算结果(Wf)的准确性。试以15，16-二氢丹参酮I为内参物，Ws/Wf在42.90% ～ 122.70%之间，各成分外标法与一测多评法结果差异显著；而以丹参酮IIA为内参物，Ws/Wf在95.70% ～ 101.70%之间，结果令人满意。加之丹参酮IIA作为丹参中含量较高的主要有效成分，且对照品较其他成分容易得到，故在本研究中选用丹参酮IIA为内参物。

3.1.5 一测多评法与外标法的比较 为了验证所建立的一测多评方法的准确性，本研究比较外标法测定结果与一测多评法计算结果，见表1。结果表明，根据得到的校正因子计算103份复方丹参片样品中4个药效成分的含量和外标法计算得到的4个药效成分的含量之间的RE(相对误差)值均<5%，并且配对t检验分析结果表明同一成分分别用两种方法测定的含量之间无统计学差异(P>0.05)。此外，采用外标法与一测多评法所得含量的比值(Ws/Wf)评价一测多评法的准确度，比值为95.70% ～ 101.70%，说明建立以丹参酮IIA为内参物的一测多评法的准确度与外标法相当。

3.2 复方丹参片的质量评价

以丹参酮IIA为参照成分，一测多评法计算103份复方丹参片样品中4种丹参酮类的含量，15，16-二氢丹参酮I含量为0.079～0.809 mg·g-1，平均值0.325 mg·g-1；隐丹参酮含量为0.307～2.017 mg·g-1，平均值为0.814 mg·g-1；丹参酮I的含量为0.229～3.138 mg·g-1，平均值为0.814 mg·g-1；丹参酮IIA的含量为0.620 ～2.982 mg·g-1，平均值为1.116 mg·g-1，4种丹参酮成分的总量(总丹参酮)为1.493～8.459 mg·g-1，平均值3.226 mg·g-1。结果可见，不同生产企业、批号复方丹参片的丹参酮类的含量参差不齐，说明市面上的复方丹参片存在质量差异，这可能与原药材的质量、生产工艺等有关。丹参药材的产地、采收、加工、炮制等对丹参酮类成分的影响较大，以四川中江、辽宁凌源和山东平邑所产的丹参中丹参酮含量最高；以3年生并且在10-11月采收的丹参中丹参酮类的含量较高；阴干及低温烘干法(40～60 ℃)较晒干法有利于丹参酮的保留；“发汗”能提高丹参酮类的含量；丹参药材直径越细，丹参酮类的含量越高；丹参酒炙，15，16-二氢丹参酮I、丹参酮IIA和丹参酮I的含量升高，隐丹参酮含量降低。在生产工艺方面，丹参提取物的提取时间、提取溶剂和浓缩温度都会影响丹参酮的含量[12-16]。

3.3 主成分分析与曲线估计

把103批复方丹参片的15，16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA含量数据输入SPSS 22.0统计学软件，设置提取因子数目为4，进行主成分分析，得到4个主成分得分变量(F1、F2、F3、F4)。4个主成分的贡献率分别为63.614%、25.002%、7.862%和3.522%，以各主成分因子得分与对应方差贡献率的乘积之和计算各个体的综合模型函数。表达式C有效成分= 0.63614F1+ 0.25002F2+0.07862F3+ 0.03522F4，计算得到每份复方丹参片样品的综合得分值，详见表1。

研究15，16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIA、总丹参酮与综合指标之间的关系有可能不是简单的线性关系，为此，本研究选择多种曲线模型对15，16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA、总丹参酮与综合指标之间的关系进行初步估计。在SPSS22.0软件中选择曲线估计，以主成分分析的综合得分值为因变量，15，16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA、总丹参酮分别为自变量，选择线性、对数、倒数、二次、三次、复合、幂、S、增长、增长、指数、Logistic 12种曲线拟合模型进行曲线估计。模型R2值越大，表示模型估计越准确。结果表明，15，16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮总和的拟合效果，均通过可靠性检查(P< 0.01)。在12种曲线拟合模型中(图2)，有效成分均为二次、三次方程的拟合效果最好；另外，丹参酮IIA的线性拟合效果也好，见表10。根据以上结果可知，15，16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA、总丹参酮与主成分分析的综合得分值呈正相关，并且总丹参酮的拟合效果最好，相关性最强。

注：a、b、c、d、e、f分别为15，16二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮总和与综合指标的12种拟合曲线

表10 15，16-二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮总和与综合指标的曲线估计

丹参酮类具有显著的心脑血管保护作用和抗肿瘤作用及抗菌、抗炎等多种药理作用[4]。丹参酮IIA是丹参酮类化合物最有代表性的有效成分，在心脑血管疾病方面具有很好的疗效，主要用于治疗局部缺血或动脉粥样硬化疾病；15，16-二氢丹参酮I具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、保护肝脏的作用；隐丹参酮在抗肿瘤方面具有突出的作用；丹参酮I等具有神经保护作用，可用于阿尔茨海默病的预防与治疗[17-20]。说明这4种丹参酮类成分都有其特定的药理作用。由于丹参酮中的成分复杂，不同成分之间也可能会存在相互作用。在体内代谢过程中，丹参酮具有协同作用和代谢转化作用。丹参酮提取物中的其他组分协同促进丹参酮IIA在动物体内的吸收，同时促进隐丹参酮代谢转化为丹参酮IIA；丹参酮IIA在大鼠体内可代谢产生丹参酮IIB[21-22]。

从多指标的评价角度出发，总丹参酮与综合指标的一致性较好，相关性最强，说明单一的丹参酮IIA或隐丹参酮含量还是难以反映复方丹参片的质量，而以总丹参酮最好。提示我们需要从整体的角度出发，研究各个指标之间的相关性，才能更好地明确复方丹参片的药效基础，更好地为质量评价服务。

4 结论

本研究利用丹参酮类成分化学结构的相似性，建立了以1种成分为参照计算复方丹参片中4种丹参酮成分含量的一测多评法。采用方差分析，结果表明所建立的复方丹参片丹参酮类的一测多评含量测定方法与外标法的测定结果无显著性差异。本研究采用校正因子法从量上阐明了复方丹参片中丹参酮类成分间的相互关系，建立的相对校正因子具有较好的可信度，方法简单、快速、准确，可以实现在缺少对照品的情况下对复方丹参片丹参酮类成分的含量测定。

本研究运用统计学中的主成分分析及曲线估计法对丹参酮类的含量与复方丹参片的质量进行相关性分析。总丹参酮与主成分分析的综合得分值呈正相关，并且总丹参酮的拟合效果最好，相关性最强。