养血润燥法对银屑病皮损中IRF-4表达的影响

吴世婷，刘丽芳，熊家青

(湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007)

银屑病(psoriasis，PS)是一种慢性炎症性皮肤病，西医俗称“牛皮癣”，其病程长、易反复发作，皮损表现多为红斑、鳞屑。中医病名最早见于《外科证治全书》：“白疕，一名疕风……。”此外，原文还述“渐至肢体枯燥坼裂，血出痛楚……”，认为本病最基本的病因为“血虚”，“因岁金太过，至深秋燥金用事，乃得此证”，则进一步指出本病的发病是在“血虚”的基础上“生燥”。而润肤止痒乳正是以养血润燥为原则组方配制而成，临床上用于治疗银屑病，同时还取得了不错的疗效。在银屑病的综合治疗中，中医药优势明显且效果良好，但其作用机制尚不完全明确。本实验应用免疫组化探讨润肤止痒乳对银屑病皮损中干扰素调节因子-4(IRF-4)表达的影响，以期为中医中药治疗银屑病提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物

健康雌性BALB/C小鼠(长沙市天勤生物技术有限公司)，72只，合格证号：No.43006700013161，许可证号：SCXK(湘)2014-0011，SPF级，鼠龄5周，饲养于湖南中医药大学第一附属医院SPF级实验室，环境许可证号：SYXK(湘)2015-0003。

1.2 药物及试剂

咪喹莫特乳膏(湖南科益药业)；低、高浓度润肤止痒乳(湖南中医药大学第一附属医院制剂中心配置)；中浓度润肤止痒乳(湖南中医药大学第一附属医院制剂中心自制)；他扎罗汀乳膏(重庆华邦制药)；苏木素-伊红染液套装(武汉谷歌生物科技有限公司)；氨水(国药集团)；盐酸(国药集团)；中性树胶(国药集团)；HRP山羊抗兔二抗(servicebio，TBS缓冲液(武汉谷歌)。

1.3 仪器及软件

匀浆仪(康涛科技，型号：KZ-II)；冰箱(西门子，型号：BCD-186)；超净工作台(苏净安泰，型号：SW-CJ-1FD)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016)；超微量分光光度计(Thermo，型号：NanoDrop2000)；正置光学显微镜(日本尼康，型号：Eclipse E100)；成像系统(日本尼康，型号：Nikon DS-U3)；扫描仪(EPSON，型号：V300)；电子天平(梅特勒-托利多仪器，型号：PL-203)。

1.4 动物造模及标本制作

1.4.1 建立动物模型 以区间分组法将72只小鼠随机分为6组各12只：正常对照组，空白模型组，润肤止痒乳高浓度组(0.48 g/mL)、中浓度组(0.24 g/mL)、低浓度组(0.12 g/mL)及他扎罗汀组。硫化钠脱去小鼠背部约2 cm×2 cm面积毛发。正常对照组每日以0.5 mL蒸馏水外涂，其余组小鼠每日以62.5 mg咪喹莫特乳膏外涂8天，造模。

1.4.2 实验给药方法 正常对照组及空白模型组以每日0.5 mL蒸馏水外涂小鼠背部脱毛区皮肤，其余组以相应药物外涂。

1.4.3 制作标本 以1.4.2方法于药物作用后的第3天和第8天处死每组小鼠6只，剪取背部皮损。取1/3用福尔马林固定，剩余于-80 ℃冰箱备用。

1.5 观察皮损变化

1.5.1 脱毛区皮损评价 观察每只小鼠的生命体征，拍照记录脱毛区皮损的变化、红斑鳞屑的情况等。

1.5.2 苏木素-伊红HE切片染色观察 以“1.4”中方法取标本，固定液固定标本24 h，自来水反复冲洗，低到高浓度梯度逐级置于乙醇中脱水，二甲苯浸泡至透明。蜡包裹标本。包埋后，制成3 μm切片，脱蜡脱水。苏木素染色3～5 min，盐酸及氨分色，冲洗；再用酒精脱水，伊红染液中染色2～5 min。脱水后中性树胶封片，显微镜下采集图像及分析图像。

1.5.3 免疫组化检测IRF-4 方法同“1.5.2”，先将石蜡切片脱蜡至水，抗原修复缓冲液浸泡，PBS洗涤玻片；50 μL 3%H2O2溶液灭活10 min；小牛血清封闭10～30 min；一抗4 ℃孵育过夜；再二抗37 ℃孵育50 min；DAB显色液浸泡至棕黄色；苏木素复染1～3 min，盐酸酒精分化，自来水冲洗，氨水反蓝；低到高浓度梯度二甲苯和酒精中浸泡，封片。显微镜镜下观察进行图像采集和分析。分析累积光密度值(integral optical density mean，IOD)，IOD值越大表明IRF-4表达越多，越小则反之。

1.6 统计学处理

2 结果与分析

2.1 外观及HE染色判断造模成功与否[1-4]

正常对照组小鼠脱毛区皮肤正常，未见明显改变；模型组小鼠的背部脱毛区皮肤出现红斑、丘疹、鳞屑，具体见图1。以“1.4.3”取得的模型组小鼠标本，HE染色显示符合银屑病皮损改变，具体见图2。 由以上两点，说明造模成功，可继续进行下一步实验。

2.2 IHC检测IRF-4的表达

造模成功后，分析各组以相应药物作用3天及8天后的IRF-4的IOD值并比较发现：所有组与空白模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；润肤止痒乳高浓度组、润肤止痒乳低浓度组及他扎罗汀组中IRF-4的表达高于正常对照组(P<0.05)，而与润肤止痒乳中浓度组比较差异无统计学意义(P>0.05)；润肤止痒乳中浓度组中IRF-4表达低于润肤止痒乳高及低浓度组(P<0.05)；润肤止痒乳高、中及低浓度组与他扎罗汀组中IRF-4的表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。可以得出模型中银屑病皮损中IRF-4的表达要高于正常皮肤，湖南中医药大学第一附属医院自制剂、润肤止痒乳治疗银屑病的疗效与西药制剂他扎罗汀疗效相当，其中润肤止痒乳在临床常用浓度0.24 g/mL时疗效最优，润肤止痒乳治疗银屑病的机制可能为抑制IRF-4的表达，且0.24 g/mL浓度对IRF-4的抑制作用最为明显。具体数值见表1，染色情况见图3、图4。

第1天 第3天 第5天 第7天

注：除正常对照组外，其余各组小鼠皮肤随药物作用的天数及次数的增加，红斑、丘疹、鳞屑皮损等皮损增多且明显。

图1 小鼠皮肤

组别第3天第8天正常对照组3218.34±1.4847E3*2737.95±1.3893E3*空白模型组11215.38±3.9498E311466.73±3.5053E3润肤止痒乳低浓度组8927.98±7.2712E3*#▲★6706.71±2.2115E3*#▲★润肤止痒乳中浓度组5023.60±1.9930E3*△★2979.41±1.6610E3*△★润肤止痒乳高浓度组8289.92±1.7537E3*#▲★5111.60±2.4675E3*#▲★他扎罗汀组6959.22±1.0187E3*#△☆4383.71±1.3547E3*#△☆

注：与空白模型组比较，*P<0.05；与正常对照组比较，#P<0.05，△P>0.05；与润肤止痒乳中浓度组比较，▲P<0.05，☆P>0.05；与他扎罗汀组比较，★P>0.05。

注：①②③为正常对照组外小鼠药物作用后3天于光镜下×40、×100、×200所见，表皮增厚、颗粒层减少，上皮细胞增生，淋巴细胞浸润；④⑤⑥为正常对照组外小鼠药物作用后3天于光镜下×40、×100、×200所见，表皮增厚、颗粒层消失，角化过度，上皮细胞增生，淋巴细胞浸润。

图2 HE染色

注：A：正常对照组；B：空白模型组；C：润肤止痒乳高浓度组；D：润肤止痒乳中浓度组；E：润肤止痒乳低浓度组；F：他扎罗汀组

注：A：正常对照组；B：空白模型组；C：润肤止痒乳高浓度组；D：润肤止痒乳中浓度组；E：润肤止痒乳低浓度组；F：他扎罗汀组

3 讨论

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病。在国内外关于银屑病的发生发展研究和临床观察中，认为辅助性T细胞17(h17)及其相关细胞因子起着重要作用[1-2]。IRF-4是转录因子IRF家族中的一员，是由一系列广泛的有丝分裂刺激所产生的，例如抗原受体参与、脂多糖和CD40信号[3-4]。同时也证实IRF-4是淋巴细胞、髓细胞树状细胞分化和成熟过程中几个步骤的关键调控因子[5]。研究还表明，在银屑病皮肤皮损中，尤其是角质形成细胞和炎症细胞中，IRF-4表达明显升高，故下调和抑制IRF-4的表达可能是治疗银屑病和其他自身免疫性疾病的一种方式和新的突破口[6-7]。

中医认为本病的致病因素多与外感或内生风、燥、热、湿、毒等有关，且认为本病的发病是在患者本已“血虚”的基础上，加之外感风邪，血虚内燥不能濡养皮肤而发病。中医名“玄府”即汗孔，是中医学中特有的一种概念。在临床中，银屑病患者常常表现为冬季病情加重。夏季病情减轻，究其根本，中医认为人在冬季，因其气候寒冷，故人肌肤腠理随之相对致密，玄府郁闭而致肌肤无汗，气无法向外流行布散，阴津也就无法向外布散濡养肌肤毛孔，肌肤失于濡养则干燥脱屑，故病情加重。而夏季气候温暖，人肌肤腠理疏松，玄府通利，肌肤得阴津之濡润，故病情较轻。正如《灵枢·五癃津液别》所载：“天暑衣厚则腠理开，故汗出……天寒则腠理闭，气湿不行。”故银屑病的主要病因病机为“血虚风燥，玄府闭密”[8]。而润肤止痒乳的配方配伍是以中医养血润燥法[9]为主，配以生地、当归补血养血，使其皮毛玄府有所濡养；肺主皮毛，调控玄府，故以何首乌养阴补血以养肺；以桃仁和红花活血加行气以通畅玄府；平肌肤之风以止痒，故配以地肤子、苦参、蚕砂加上蛇床子燥湿祛风；杏仁和瓜蒌霜清热清热润肠以滋肺阴；薄荷、冰片清凉发散，宣发药物以止痒。

本研究结果显示，润肤止痒乳对银屑病的治疗与抑制银屑病皮损中IRF-4的表达和调节免疫有关，其效果与他扎罗汀相当甚至更优，且中医中药因其较小的副作用而可更好地应用于临床。本实验初步证实了养血润燥法治疗银屑病的作用及作用机理，但是中医中药治疗银屑病的作用机理还需要更多的临床及实验研究来探究。