白藜芦醇β-环糊精包合物在大鼠体内生物利用度研究

于琛琛，张纯刚，程 岚

(辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600)

白藜芦醇(C14H12O3)化学名称为3，5，4′-三羟基二苯乙烯，是一种无色针状晶体，易溶于乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂[1-2]。其水溶性较差，但细胞膜通透性很高，属于BCSⅡ类化合物[3]。白藜芦醇在自然界的存在形式主要有2种：顺式和反式白藜芦醇[4]。白藜芦醇的顺式异构体与反式异构体均具有光敏性，在光照条件下会有部分互相转化，故应避光保存[5]。现已发现白藜芦醇具有多种药理活性，如抗肿瘤、抗炎、抗血小板聚集、抗细菌和真菌感染、影响胃酸分泌、调节血脂等[6-12]。但是其水中溶解度较差，导致其体内生物利用度较低，严重影响了其广泛应用。本实验通过将白藜芦醇制备成β-环糊精包合物，提高其水溶性，并进行了大鼠体内的药物动力学研究，进而提高其体内生物利用度。

1 材料

高效液相色谱(岛津SHIMADZU，2010A-HT)；涡旋混合器Vortex-5(IKA，Vortex 3)；高速离心机(上海安亭科学仪器厂，TGL-16 g)。

白藜芦醇原料药(API)(98%，武汉远成共创科技有限公司，20171225)；白藜芦醇-β-环糊精包合物(自制，白藜芦醇∶β-环糊精质量比=1∶2)；卡马西平对照品(内标，上海哈灵生物科技有限公司，100142-201605)；白藜芦醇标准品(南京森贝伽生物科技有限公司，111535-201502)；色谱甲醇和色谱乙腈(SIGMA)；醋酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

雄性SD大鼠12只，体质量(250± 20)g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，动物许可证号：SCXK(辽)2015-0001。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent Extend-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：水∶乙腈=70∶30(v/v)，流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃，检测波长：320 nm，进样量30 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 白藜芦醇系列对照品溶液的配制 精密称取白藜芦醇标准品适量，用甲醇溶解并定容浓度为250 μg/mL的储备液，于4 ℃保存。临用前，用甲醇稀释定容，浓度分别为100、200、1 000、2 000、5 000、10 000、25 000 ng/mL的标准工作液。

2.2.2 内标液的配制 取卡马西平标准品，用甲醇配置浓度为250 μg/mL的储备液，于4 ℃保存。临用前，用甲醇定容成浓度为25 μg/mL的内标工作液。

2.3 血浆样品的处理

取大鼠血浆样品100 μL，置于2 mL EP管中，加入甲醇10 μL，加入内标液10 μL，加入醋酸溶液(0.5% v/v)50 μL，加入乙腈200 μL，涡旋混合3 min，离心10 min(12 000 rpm)，取上清液进样。

2.4 给药方案与血样采集

将雄性SD大鼠12只随机分成2组，给药前不禁水，禁食12 h，一组口服灌胃原料药(20 mg/kg)，另一组给予白藜芦醇β-环糊精包合物(含白藜芦醇20 mg/kg)；并于给药后5、10、15、30、45、60、120、240、 480、720 min眼眶取血0.2 mL置于肝素化的EP管中，离心(4 000 rpm)，取上清液于-20 ℃冰冻保存备测。

2.5 方法学考察

2.5.1 方法专属性 分别取6只雄性SD大鼠空白血浆100 μL，将加入内标溶液10 μL改为加入甲醇10 μL，其余按“2.3血浆样预处理”项下的方法操作，得空白血浆样品色谱图1-A；将白藜芦醇标准溶液和内标溶液加至空白血浆中，依同法操作，得色谱图1-B，其中白藜芦醇和内标(卡马西平)的保留时间分别为3.86和7.25 min；取给药后的血浆样品，依同法操作，得色谱图1-C。结果表明，血浆中内源性物质不干扰白藜芦醇和内标(卡马西平)的测定。

A.大鼠空白血浆；B.大鼠空白血浆加白藜芦醇和内标物；C.给药后30 min的血浆图1 HPLC法测定血浆中白藜芦醇(Ⅰ)和内标(Ⅱ)的典型色谱

2.5.2 标准曲线、线性关系及定量下限 配成浓度相当于10、20、100、200、500、1 000、2 500 ng/mL的白藜芦醇血浆对照品溶液，再按“2.3”项处理后检测，所得数据以血浆中白藜芦醇的浓度X对白藜芦醇与内标的峰面积比值Y进行线性回归绘制标准曲线。得标准曲线回归方程：y=0.005 8x+0.211 3(r=0.999 5)。结果表明，白藜芦醇在10～2 500 ng/mL线性关系良好，最低定量为10 ng/mL。

2.5.3 方法精密度和准确度 取大鼠空白血浆100 μL，加入高、中、低3种质量浓度的标准溶液各10 μL，配制成质量浓度分别为 20.0、500.0、2 000.0 ng/mL的质量控制(QC)样品，每一质量浓度进行6样本分析，连续进样3天，用随行标准曲线测得QC样品的质量浓度，与配制质量浓度对照，求得血浆样品测定方法的准确度与精密度，白藜芦醇低、中、高3个浓度的日内精密度分别为3.26%，4.60%，3.40%；日间精密度分别为4.54%，3.63%，3.98%。准确度分别为(100.0±3.26)%，(99.0±4.6)%，(97.2±3.3)%，结果表明白藜芦醇血浆样品测定方法的精密度和准确度符合要求。

2.5.4 提取回收率 配制低、中、高3种浓度(20.0、500.0、2 000.0 ng/mL)的白藜芦醇血浆对照品溶液，每种浓度6份，再按“2.3”项处理后检测。另取同样浓度的白藜芦醇对照品各6份于试管中，不加空白血浆，按“2.3”项处理后检测，依据标准曲线计算各自的浓度，低、中、高3种浓度的相对回收率分别为(96.6±2.6)%、(100.5±2.2)%和(99.0±4.4)%。内标卡马西平的提取回收率为(99.6±2.5)%。

2.5.5 样品稳定性 本实验考察了白藜芦醇血浆样品室温放置2 h、处理后进样室温(4 ℃)放置24 h、经历1次和3次冷冻-解冻循环和-20 ℃冰冻30 d的稳定性。进行稳定性考察时，取空白血浆100 μL，加入白藜芦醇低、中、高三个质量浓度的系列质量控制溶液10 μL，配制成低(20 ng/mL)、中(500 ng/mL)和高(2 000 ng/mL)的3个质量浓度的QC样品，每一浓度进行3样本分析。实验结果说明白藜芦醇血浆样品在避光条件下室温放置2 h、处理后进样室温(4 ℃)放置24 h、经历1次和3次冷冻-解冻循环和-20 ℃冰冻30 d均可保持稳定(相对偏差均在15%之内)。数据见表1。

表1 在不同条件下白藜芦醇样品的稳定性

2.6 药动结果

采用 DAS 3.0药动学软件处理口服白藜芦醇原料药和制剂的血药质量浓度测定数据，将血药浓度(C)与时间(t)数据用 DAS3.0拟合，测得平均血药浓度-时间数据见图2。主要药动学参数见表2。

图2 RES原料药和RES-β-环糊精包合物在大鼠体内的药-时曲线

表2 白藜芦醇在大鼠体内主要药动学参数

3 讨论

根据白藜芦醇及卡马西平的理化性质，考察了采用甲醇、乙腈直接沉淀蛋白方法进行血浆样品处理。由于采用甲醇进行沉淀蛋白处理血浆样品，不能完全地除去蛋白，而采用乙腈沉淀蛋白。血浆中加入2倍量的乙腈，可充分沉淀蛋白并且提取RES效率较高，操作简单、方便、效率高。最终选定加入2倍量乙腈作为沉淀试剂。

采用HPLC-UV法测定大鼠血浆中白藜芦醇的质量浓度，经过流动相配比及选择后确定采用乙腈∶水(30∶70)，可获得较短的保留时间，同时又可以与杂质峰分离，样品分析时间短，1次测定只需8.0 min，本方法定量下限为10 ng/mL，能满足白藜芦醇体内药动学研究。

生物等效性统计学评价中进行Cmax和AUC的方差分析，与RES原料药比较，白藜芦醇-β-环糊精包合物Cmax和AUC都具有显著性差异(P<0.05)，制剂组的Cmax和AUC都具有较明显的提高。从表1中可以看出，RES原料药组AUC0-t和AUC0-∞分别为(514.7±117.5)和(543.7±102.2)ng/mL*h，白藜芦醇-β-环糊精包合物组的AUC0-t和AUC0-∞分别为(1 191.4±147.9)和(1 396.4±196.4)ng/mL*h，白藜芦醇口服制剂与原料药对比，其相对生物利用度为225.6%。RES原料药组Cmax为(473.3±200.8)ng/mL，白藜芦醇-β-环糊精包合物组为(1 135.3±60.6)ng/mL，提高了2.4倍多。与原料药组相比，达峰时间更快。t1/2由原料药的2.56 h延长至4.42 h。实验结果显示，白藜芦醇经过β-环糊精包合后，药物在体内的吸收具有较明显的提高。其吸收峰浓度显著提高，同时制备的β-环糊精包合后半衰期明显延长，提示将白藜芦醇制备成环糊精包合物是可以较好地提高其口服吸收。本文作者建立了 HPLC-UV法用于测定大鼠血浆中白藜芦醇的浓度，首次报道了白藜芦醇-β-环糊精包合物(白藜芦醇：β-环糊精质量比=1∶2)大鼠体内的药动学情况，为白藜芦醇体内血药浓度的测定和药动学的研究提供参考依据。为了更好地评价白藜芦醇的药用价值，对其在体内的分布、排泄及代谢产物特点有待进一步研究。