葛根散对酒伤ED大鼠阴茎平滑肌组织β-catenin mRNA及蛋白表达的影响

张琪其，杨晓筱，罗仕艳，王庆学

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

传统中医将因不合理的饮酒而产生的身体伤害称为“酒伤”。现代医学中，“酒伤”涵盖了由于饮酒不当导致机体产生的多系统疾病[1]。其在生殖系统主要表现为ED，即阴茎持续不能达到或维持足够的勃起进行满意性交达3个月以上，且随当代社会人群饮酒量的增加，其发病率日益增加，对患者身心健康都有很大的负面影响。据统计，目前中国40岁以上男性ED的患病率约为40.56%[2]。预计全球在2025年约有3.22亿ED患者[3]，酒伤所致ED将占相当比重。ED的发病机制复杂，其中阴茎海绵体平滑肌(corp-us cavernosum smooth muscle，CCSM)结构与功能不健全是其发生的一个重要因素。阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSMCs)是构成CCSM的基本单位，也是保障CCSM结构与功能健全的基本单位。阴茎的勃起依赖CCSMCs快速协同一致兴奋舒缩而产生，缝隙连接(gap junction，GJ)被认为是维持这种整体协调性的结构基础，构成阴茎海绵体平滑肌缝隙连接的主要连接蛋白是连接蛋白43(connexin43，Cx43)[4]。有研究发现，Cx43基因与蛋白的表达可明显被β-catenin干预[5]。β-catenin在机体多种组织细胞中均有表达，如平滑肌细胞、成骨细胞、成纤维细胞等，既可作为一种细胞骨架蛋白存在于细胞膜，同时在细胞质和细胞核中也有表达。可通过介导细胞间黏附、以转录因子形式调控基因与蛋白的表达，从而调节细胞增殖、分化和调亡[6]。经典解酒方——葛根散有防治饮酒过度所造成的酒毒内蕴之功效，现代医学研究发现，此方在治疗酒伤大鼠ED方面亦有较为明显的效果，可以显著增加酒伤雄性大鼠追逐雌性大鼠次数、预防或修复酒伤大鼠睾丸组织病理损伤[7]。本实验旨在探讨葛根散对酒伤ED大鼠阴茎平滑肌组织β-catenin mRNA及蛋白表达的影响，进一步了解葛根散治疗酒伤ED的具体作用机制，为中医药治疗酒伤ED提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级SD雄性大鼠35只，体重(180±20)g，购自贵州中医药大学实验动物中心[许可证号：SCX(黔)20020001)]。

1.2 主要试剂与仪器

56%红星二锅头白酒(北京红星股份有限公司，批号100809)；Animal Total RNA lsolation Kit(FOREGENE公司，批号RE-03014)；RT EasyTM II(First-strand cDNA synthesis for Real Time PCR)(FOREGENE公司，批号RT-01023)；Real Time PCR EasyTM(FOREGENE公司，批号QP-01014)；ZS-2型板式酶标仪(北京市新风机电技术公司)BCA蛋白定量试剂盒(江苏康为世纪公司，批号：CW0014)；PIKORed 96型实时荧光定量仪(型号：RT-PCR，美国ThermoFisher仪器有限公司)；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(江苏康为世纪公司，批号：CW0022)；Wester blotting ladder pen(江苏康为世纪公司，批号：CW2502)；ECL高灵敏度化学发光检测试剂盒(江苏康为世纪公司，批号：CW0049)；EPS-300型电泳仪(美国BIO-RAD公司)；Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System蛋白电泳槽(美国BIO-RAD公司)；Mini Trans-Blot蛋白转印系统(美国BIO-RAD公司)；抗β-Actin鼠单克隆抗体(江苏康为世纪生物公司，批号：CW0096A)；抗β-Actin兔多克隆抗体(江苏康为世纪生物公司，批号：CW0097A)；β-catenin(美国Proteintech公司，批号：51067-2-AP)；ChemiDocTM XRS+化学发光凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。

1.3 实验药材

葛根散(金·张子和《儒门事亲》)：由葛花、甘草、葛根、砂仁、贯众等组成。组方药材购自贵州中医药大学第一附属医院，按原方比例常规制备水煎剂(调整生药浓度为1 g·mL-1)备用。

1.4 动物分组、造模及给药

健康清洁级雄性SD大鼠，共35只，每组7只，随机分成5组，即：空白组，模型组，葛根散低、中、高剂量组(0.05 g·10 g-1、0.1 g·10 g-1、0.2 g·10 g-1)。空白组以等量生理盐水灌胃，模型组和葛根散低、中、高剂量组以红星二锅头白酒按1.5 mL·100 g-1·d-1灌胃。每天灌酒30 min后，葛根散低剂量组、葛根散中剂量组、葛根散高剂量组以不同浓度的葛根散水煎剂灌胃，空白组和模型组代以等量生理盐水，连续30 d。最后一次灌胃2 h后，处死并摘取大鼠阴茎。

1.5 RT-PCR法检测葛根散对酒伤ED大鼠阴茎平滑肌组织β-catenin mRNA表达的影响

按照超纯RNA试剂盒说明从大鼠阴茎平滑肌组织制备总RNA，分光光度计测定总RNA浓度和纯度，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，按cDNA反转录试剂盒说明进行逆转录。PCR扩增条件为95 ℃预变性30s，95 ℃变性5s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸30 s，循环次数45个。目的基因作为引物和以GAPDH作为内参基因，引物列为GAPDH，上游引物序列5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′，下游引物序列5′-CCACCCTGTTGCTGTAGCCATA-3′，扩增产物长度270bp；β-catenin上游引物序列5′-GCCAGTGGATTCCGTACTG-3′，下游引物序列5′-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3′，扩增产物长度202bp。实验重复3次，扩增结束后计算扩增效率，并计算β-catenin基因的相对表达水平

1.6 Western Blot法检测葛根散对酒伤ED大鼠阴茎平滑肌组织β-catenin蛋白表达的影响

按组织蛋白提取试剂盒说明进行蛋白提取，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，将制备好的蛋白样品加入10%的凝胶中电泳，转膜，取膜，将其加入封闭液中，保持20 min，用蒸馏水将一步法试剂盒中的10×洗液稀释成1×洗液；取二抗HRP至4 mL离心管中，再取一抗与二抗混匀，室温孵育5 min，加入一步法抗体稀释液。其中，一抗β-catenin浓度(1∶1 000)，二抗β-catenin浓度(1∶200)，一抗内参β-actin浓度(1∶5 000)，二抗内参β-actin浓度(1∶200)，倾去抗体混合液，用洗液漂洗3次，5 mL×5 min。ECL显色曝光，分析结果。

1.7 统计分析

2 结果

2.1 RT-PCR法检测葛根散对酒伤ED大鼠阴茎平滑肌组织β-catenin mRNA表达的影响

与正常组比较，模型组β-catenin mRNA表达水平显著下降(P<0.05)。与模型组比较，葛根散中、高剂量组β-catenin mRNA表达水平显著上升(P<0.05)。见表1。

组别浓度(g·10g-1)β-cateninmRNA正常组-1.08±0.05模型组-0.37±0.13*葛根散低剂量组0.050.49±0.15*葛根散中剂量组0.10.61±0.11*#葛根散高剂量组0.20.72±0.21*#

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.2 Western Blot法检测葛根散对酒伤ED大鼠阴茎平滑肌组织β-catenin蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组β-catenin蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。与模型组比较，葛根散低、中、高剂量组β-catenin蛋白表达水平显著上升(P<0.05)。且葛根散高剂量组β-catenin蛋白相对表达水平与正常组比较无统计学差异(P>0.05)。见表2、图1。

组别浓度(g·10g-1)β-catenin蛋白正常组-0.73±0.10模型组-0.24±0.03*葛根散低剂量组0.050.36±0.06*#葛根散中剂量组0.10.46±0.05*#葛根散高剂量组0.20.53±0.09#

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

注：A正常组；B模型组；C葛根散低剂量组；D葛根散中剂量组；E葛根散高剂量组

图1 葛根散对酒伤ED大鼠阴茎平滑肌
组织β-catenin蛋白条带

3 讨论

随着社会经济不断发展及生活方式的变化，我国成年男性人群ED发病率持续升高[8]。CCSM是维持阴茎勃起的重要结构，研究表明，当CCSM舒张时，血液灌注、回流受阻，阴茎勃起；当CCSM收缩时，血液回流，阴茎处于松弛状态。组成CCSM的CCSMCs作为保障CCSM结构与功能的基本单位，其增殖、分化和凋亡对阴茎能否正常勃起有重要意义。Cx43是CCSMC细胞之间信号通讯的主要连接蛋白[9，10]，是CCSMCs相邻细胞信息交流的主要通道，对协调CCSMC同步舒缩意义重大。而β-catenin广泛存在于各种类型的细胞中，由CTNNBl基因编码，参与细胞间蛋白的转录及活性的调控。当受到细胞因子激活后，β-catenin进入细胞核内，细胞间蛋白随β-catenin的表达增多而增多。有研究表明，β-catenin还具有促进细胞增殖与分化之功效，如促血管平滑肌细胞增殖[11]。

葛根散出自金代张子和所著《儒门事亲》，由葛花、甘草、葛根、砂仁、贯众组成，有利湿健脾、散毒解酒的功效[12]。葛根散主治饮酒过度、酒毒内蕴者，即从根本上清除酒热湿毒，补益肝肾。现代药理研究表明，此方剂中葛花所含成分皂角苷具备氧化还原的作用，可以促进乙醇氧化而保护胃肠黏膜，同时减缓酒精吸收入血而降低酒精浓度[13]。此方剂酒前服用或酒后服用均有效，可有效缓解因饮酒不当导致的不适症状。

前期研究发现葛根散可以减轻或修复酒伤大鼠睾丸组织病理损伤，可以在一定程度上改善雄性酒伤大鼠的性欲[7]。本实验结果显示，与正常组比较，模型组β-catenin mRNA及蛋白表达水平显著下降。与模型组比较，葛根散中、高剂量组β-catenin mRNA表达水平显著上升，葛根散低、中、高剂量组β-catenin蛋白表达水平显著上升。且葛根散高剂量组β-catenin蛋白相对表达水平与正常组比较无统计学差异。因此，葛根散治疗酒伤ED的机制之一可能与上调β-catenin mRNA及蛋白表达水平，进而提高Cx43蛋白表达水平有关[14]。加强CCSMCs细胞间联系，为酒伤ED患者的临床治疗提供了理论依据。β-catenin是否能促进CCSMCs增殖与分化，通过增加CCSMCs细胞数量以改善阴茎勃起功能，还有待于进一步研究。