酸性蛋白酶提取白酒丢糟中淀粉条件优化研究

牟婷婷，李怡萱，李 丽，王祥余，宗绪岩*

（1.四川轻化工大学 生物工程学院，四川 宜宾 644000；2.诺维信（中国）投资有限公司，北京 100085）

以高粱、大米、小麦、糯米等粮谷为原料，经过发酵蒸酒后残留的固体混合物就是白酒酒糟。白酒酒糟经过发酵蒸馏后仍残留着丰富的成分，比如淀粉，蛋白质、纤维、多糖、氨基酸、维生素和微量元素，还含有丰富的醇类、酯类、酸类、芳香类等发酵产物[1-7]。其中主要成分为粗淀粉含量在5.71%～11.34%，粗蛋白含量5.00%～13.84%，以及粗脂肪1.31%～3.24%[8]。酒糟的类型主要有两大类，一类是处于正常生产过程的酒糟，包括粮糟、红糟、以及上轮留下的母糟；另一类为即将丢弃的酒糟，有面糟和丢糟。据统计，我国白酒酿造行业每年产生约2 500万t的丢糟。白酒丢糟中含水量大、酸度高，堆积储放时极易霉变腐烂，若随意丢弃或焚烧，会造成严重的环境污染[9]。目前酒糟的研究方向主要是酒糟的利用方面，比如：生产酒糟饲料，生产燃料棒和燃料乙醇，提取纤维素、半纤维素和膳食纤维，酒糟生产生化产品，酒糟酿醋，酒糟再利用酿酒，培养食用菌，提取多酚、类黑精等附加值产物，生产能源和有机酸等方面[10-17]。主要是对丢糟中的粗蛋白和粗纤维的利用研究，而对丢糟中淀粉的研究较少。由于浓香型白酒的特殊工艺是续糟发酵，即一部分已经经过发酵蒸酒后的酒糟拌和部分新粮再进行下轮次的发酵和蒸酒，如此反复循环。在丢糟中，一部分淀粉因为被蛋白紧密结合，导致淀粉酶不能直接接触淀粉，从而不能降解淀粉。本研究通过酸性蛋白酶处理丢糟，降解包裹在淀粉外的蛋白质，使其中的淀粉裸露出来，并采用单因素及正交试验优化淀粉提取条件。本研究将丢糟中抗酶解淀粉转化为可降解淀粉的方法，以提高丢糟抗酶解淀粉的利用率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丢糟：宜宾今良造制造酒公司；P15酸性蛋白酶（15 010 00 U/g）：百斯杰酶制剂公司；淀粉酶（140 340 U/g）、糖化酶（301 200 U/g）：诺维信酶制剂公司；牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）（＞99.0%）：如吉生物科技；氢氧化钠、乙醇、盐酸、3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）、酒石酸钾钠、苯酚、无水亚硫酸钠、葡萄糖、磷酸、考马斯亮蓝G250（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

CP124C型电子天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司；DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；UV2400型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；BHS-6型恒温水浴锅：宁波市鄞州群安实验仪器有限公司；Lynx6000型高效落地高速冷冻离心机：美国Thermo Scientiric公司；PL4-00型打浆机：咸阳易安机电工程有限公司；

1.3 实验方法

1.3.1 丢糟前处理

取适量丢糟，加入适量蒸馏水倒入打浆机进行打磨，使丢糟高粱壳中残留的淀粉脱落，打磨结束后，将酒糟液过20目筛，以去除酒糟中的稻壳，再将过筛后的酒糟液进行离心，5 000 r/min，5 min，离心3次，保存离心后的沉淀，备用。

1.3.2 提取条件优化单因素试验

酶解温度的确定：称取经前处理的丢糟5.0 g，按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸馏水，充分搅拌形成悬浊液，以0.1 mol/L氢氧化钠溶液或0.1 mol/L盐酸溶液调节悬浊液pH至3.0，加入0.02 mL/g的酸性蛋白酶，酶解时间为60 min，分别在酶解温度为35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃条件下对悬浊液进行酶解。酶解结束后，立即5 000 r/min，5 min冷冻离心3次，弃除沉淀，并立即检测上清液中的淀粉和蛋白含量。

酶解pH的确定：称取经前处理的丢糟5.0 g，按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸馏水，充分搅拌形成悬浊液，酶解温度为65 ℃，酶添加量为0.02 mL/g，酶解时间为60 min，分别在pH值分别为2、3、4、5、6条件下对悬浊液进行酶解。酶解结束后，立即在5 000 r/min、5 min条件下冷冻离心3次，弃除沉淀，并立即检测上清液中的淀粉和蛋白含量。

酶解时间的确定：称取经前处理的丢糟5.0 g，按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸馏水，充分搅拌形成悬浊液，酶解温度为65 ℃，酶添加量为0.02 mL/g，pH=3.0，酶解时间分别为60 min、90 min、120 min、150 min、180 min条件下对悬浊液进行酶解。酶解结束后，立即在5 000 r/min、5 min条件下冷冻离心3次，弃除沉淀，并立即检测上清液中的淀粉和蛋白含量。

酶添加量的确定：称取经前处理的丢糟5.0 g，按料液比1∶10（g∶mL）加入蒸馏水，充分搅拌形成悬浊液，酶解温度为65 ℃，酶解时间为60 min，pH=3.0，酶添加量分别为0.01 mL/g、0.02 mL/g、0.03 mL/g、0.04 mL/g、0.05 mL/g下对悬浊液进行酶解。酶解结束后，立即在5 000 r/min、5 min条件下冷冻离心3次，弃除沉淀，并立即检测上清液中的淀粉和蛋白含量。

1.3.3 提取条件优化正交试验

以淀粉提取率为评价指标，对影响因素酶解温度、酶解pH、酶解时间、酶添加量进行L9（34）正交设计，正交试验因素与水平见表1。

表1 提取条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.4 测定方法

（1）淀粉含量的测定

采用DNS法测定淀粉含量[18]。

葡萄糖标准曲线的制作：准确称取0.100 0 g葡萄糖标准品，用蒸馏水溶解后定容至100 mL，配制成质量浓度1 mg/mL；分别移取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL、1.8 mL的质量浓度1 mg/mL葡萄糖标准溶液于25 mL具塞比色管中，分别添加蒸馏水至2.0 mL，再加入1.5 mL DNS溶液，沸水浴5 min，立即在流水中冷却，冷却至室温，用蒸馏水定容至25 mL，摇匀，在波长540 nm处测定其吸光度值。以葡萄糖含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，制作葡萄糖标准曲线，得到标准曲线回归方程为y=0.584 9x+0.003 9，相关系数R2=0.998。

丢糟样品中淀粉含量测定：提取液定容至100 mL，调节提取液的pH至5.6，放入88 ℃恒温水浴锅中，加入0.2%淀粉酶，酶解反应1h，提取液中的淀粉经淀粉酶酶解成多糖；再调节提取液的pH至4.5，放入65 ℃恒温水浴锅中，加入0.2%糖化酶，酶解反应1 h，提取液中的多糖经糖化酶酶解成葡萄糖。取0.5 mL上清液按照葡萄糖标准曲线的方法在540 nm处测其吸光度值，通过葡萄糖标准曲线回归方程计算出0.5 mL中样品的淀粉含量，淀粉提取率计算公式如下：

式中：X为淀粉提取率，%；m1为0.5 mL提取液中淀粉的含量，mg；V为提取液的总体积，mL；m2为湿丢糟的质量，g；n为湿酒糟的含水量，%。

（2）蛋白含量的测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量[19]。

牛血清蛋白标准曲线的制作：准确称取0.1000 g牛血清蛋白标准品，用蒸馏水溶解后定容至100 mL，配制成质量浓度1 mg/mL；分别移取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL的质量浓度1 mg/mL牛血清蛋白标准溶液于10 mL具塞比色管中，分别添加蒸馏水至1.0 mL，再加入5 mL考马斯亮蓝溶液，盖上塞子，放置2 min后，立即在波长595 nm处测定其吸光度值。以牛血清蛋白含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，制作牛血清蛋白标准曲线，得到标准曲线回归方程为y=0.794 6x-0.026 4，相关系数R2=0.998 5。

丢糟样品中蛋白含量测定：移取0.5 mL上清液按照蛋白标准曲线的制作中的方法在595 nm处测其吸光度值，通过标准曲线回归方程计算出0.5 mL样液中的蛋白含量，蛋白提取率计算公式如下：

式中：Y为蛋白提取率，%；m1为0.5 mL提取液中蛋白的含量，mg；v为提取液的总体积，mL；m2为湿丢糟的质量，g；n为湿酒糟的含水量，%。

（3）含水量的测定

含水量测定采用恒质量法[20]。

2 结果与分析

2.1 提取条件优化单因素试验结果分析

2.1.1 酶解温度的确定

温度在酶促反应中有相当重要的影响。当温度适当升高时，在酶促反应中会起到催化作用，会加快反应速率；当温度超过一定范围时，过高的温度会抑制酶的活性，甚至会使酶失活，从而会降低其反应速率。所以，要找到酶促反应的最适温度非常重要。但是，这个最适温度不是固定值，不是酶的特征参数。反应体系中的多种因素都会对它造成不同程度的影响，需要在不同的反应体系中加以优化[21]。

图1 酶解温度对丢糟液中蛋白和淀粉提取率的影响Fig.1 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of protein and starch from distiller's grain

选定酶解条件为：pH=3.0，加酶量0.02 mL/g，料液比为1∶10（g∶mL），丢糟分别于35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃条件下对悬浊液水解60 min，考察不同酶解温度对丢糟淀粉及蛋白提取率的影响，结果见图1。由图1可知，酶解温度在35～65 ℃时，蛋白和淀粉提取率随温度增加而上升，在酶解温度在65～75 ℃时，蛋白和淀粉提取率开始下降。原因是随着温度的升高，酸性蛋白酶的活性逐渐上升，包裹在淀粉外的蛋白质逐渐被降解，更多的淀粉裸露出来，所以在蛋白质及淀粉提取率也逐渐增加，当酶解温度＞65 ℃后，酸性蛋白酶活性降低，蛋白质及淀粉提取率也略有减少。因此，确定最佳酶解温度为65 ℃。

2.1.2 酶解pH的确定

溶液pH对整个反应体系都有重要的影响。主要的影响有三方面，其一，当反应体系的pH过高或过低时，酶活性中心的构象会改变，甚至整个酶分子结构改变而使酶失活；其二，酶活性中心常含有可离解的基团，pH会直接影响这些基团的解离程度；其三，pH也会对底物造成一定的影响。所以，确定最适pH值有利于进一步提高酶一底物（ES）的反应速率[19]。

选定酶解条件为：酶解时间60 min，酶解温度65 ℃。加酶量0.02 mL/g，料液比为1∶10（g∶mL），分别于酶解pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0条件下对悬浊液进行水解，考察不同酶解pH值对丢糟淀粉及蛋白提取率的影响，结果见图2。由图2可知，当酶解pH值为2.0～3.0时，酸性蛋白酶活性逐渐增加，悬浊液的蛋白提取率显著增加，淀粉提取率也随之增加，当酶解pH=3.0时，悬浊液中蛋白和淀粉提取率达到最大值，当溶液酶解pH＞3.0时，悬浊液的蛋白和淀粉提取率呈现缓慢下降的趋势。因此，确定最佳酶解pH值为3.0。

图2 酶解pH对丢糟液中蛋白和淀粉提取率的影响Fig.2 Effect of enzymolysis pH on extraction rate of protein and starch from distiller's grain

2.1.3 酶解时间的确定

选定酶解条件为：酶解温度65 ℃，加酶量0.02 mL/g，料液比为1∶10（g∶mL），酶解pH=3.0，分别于酶解时间为60 min、90 min、120 min、150 min、180 min条件下对悬浊液进行水解，考察不同酶解时间对丢糟淀粉及蛋白提取率的影响，结果见图3。由图3可知，当酶解时间为60～120 min时，悬浊液的蛋白和淀粉提取率随之明显的增加，当酶解时间＞120 min后，溶液中的蛋白和淀粉提取率趋于稳定。随着酶解时间的延长，酸性蛋白酶与悬浊液中的蛋白质发生酶促反应，被分解的蛋白质含量累积增加，淀粉含量也随之增加。但当酶解时间继续延长时，蛋白含量和淀粉含量的增幅较平稳，其原因可能是悬浊液中的底物蛋白质已经被降解完全了，即使延长酶解时间，蛋白提取率没有明显的增加，所以淀粉也未有明显增幅；也可能是酸性蛋白酶的添加量有限，酶的活性已经逐渐衰弱了。因此，确定最佳酶解时间为120 min。

图3 酶解时间对丢糟液中蛋白和淀粉提取率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on extraction rate of protein and starch from distiller's grain

2.1.4 酶添加量的确定

一般来说，在反应过程中，随着酶添加量的增加，反应速率应随之增加。但当底物浓度不变，而酶添加量持续增加时，产物得率不会随着酶添加量的增加有明显的增加，因为此时底物已被彻底分解，酶量的增加对产物得率没有明显的作用，同时，对于实际生产，还会增加不必要的成本。而且酶添加量过大，快速促进酶促反应，产生大量的分解物，有可能对酶产生反馈抑制，就会降低反应速率[20]。

选定酶解条件为：温度65 ℃，料液比为1∶10（g∶mL），pH=3.0，酶解时间60 min，分别于酶添加量为0.01 mL/g、0.02 mL/g、0.03 mL/g、0.04 mL/g、0.05 mL/g条件下对悬浊液进行水解，考察不同酶添加量对丢糟淀粉及蛋白提取率的影响，结果见图4。由图4可知，当酶添加量为0.01～0.02 mL/g时，蛋白及淀粉提取率均随之增大，当酶添加量为0.02 mL/g时，蛋白与淀粉提取率达到最大值，当酶添加量＞0.02 mL/g之后，蛋白和淀粉提取率均有轻微的下降趋势。当酶添加量增加时，可以增加酶浓度，促进蛋白分解速率，从而使更多与蛋白结合的淀粉被释放，使淀粉酶可以直接接触淀粉而被分解利用，所以，酸性蛋白酶的添加量增加，就间接使悬浊液中的淀粉含量增加。而当酶添加量持续增加后，蛋白含量与淀粉含量反而有轻微的减少，原因一可能是酶浓度过大，产生了大量的水解物，而对酶产生了抑制作用，所以蛋白含量有所减少，从而使淀粉含量有所降低。因此，确定最佳酶添加量为0.02 mL/g。

图4 蛋白酶添加量对丢糟液中蛋白和淀粉提取率的影响Fig.4 Effect of protease addition on extraction rate of protein and starch from distiller's grain

2.2 提取条件优化正交试验结果分析

在单因素试验基础上，以淀粉提取率、蛋白提取率为评价指标，对影响因素酶解温度、酶解pH、酶解时间、酶添加量进行L9（34）正交设计，正交试验结果见表2，极差分析结果见表3，方差分析结果见表4。

表2 提取条件优化正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3 正交试验结果极差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experiment results

由表3可知，以极差R来判断各因素的主次顺序，影响淀粉提取率的主要因素是酶解温度，其次是酶解pH，然后是酶解时间，影响最小的因素是酶添加量；影响蛋白提取率的主要因素是酶解pH，其次是酶解温度，然后是酶解时间，影响最小的因素是酶添加量。以淀粉提取率和蛋白提取率为考察指标，最佳提取条件组合均为A3B3C2D2，即酶解温度为75 ℃，酶解pH=4，酶解时间为120 min，酶添加量为0.02 mL/g。在此最佳提取条件下进行3次平行验证试验，淀粉提取率为24.26%，蛋白提取率为12.21%。

表4 正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表4可知，以淀粉提取率为考察指标，酶解温度、酶解pH、酶解时间、酶添加量对提取率有极显著的影响（P＜0.01）；以蛋白提取率为考察指标，酶解温度、酶解pH、酶解时间对提取率有极显著的影响（P＜0.01），酶添加量对提取率无显著影响（P＞0.05）。

3 结论

通过单因素及正交试验，得到最佳提取条件为酶解温度75 ℃，酶解pH4，酶解时间120 min，酶添加量0.02 mL/g。在此优化条件下，淀粉的提取率为24.26%，蛋白质提取率为12.21%。通过酸性蛋白酶提取丢糟中的淀粉，提高了丢糟中淀粉的利用率。加入酸性蛋白酶可以提高丢糟酒的出酒率，提高丢糟的经济效益。